（1）电泳检测：1×TAE缓冲液，5-7/cm电压下，电泳30min，紫外灯下观察，拍照。（2）结果分析：用Gel-Pro软件分别对3次重复的PCR结果进行数量化统计，取其平均值作为该基因在某一时期的表达量。利用Excel软件，以不同时期不同基因的表达量与内参基因（EF）表达量的比值（相对表达量，relative expression）作横...
图1 PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳 观察结果: ① 是否有扩增产物。 ②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增。 ③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较,PCR产物的长度是否正确。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。 RT-PCR检测人β-actin基因表达 扩增产物长度 260 bp 问题及解决方法 无...
1)RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction):中文名称叫逆转录PCR或反转录PCR,是指将RNA反转录成cDNA, 然后使用PCR技术对cDNA进行扩增检测的技术。普通RT-PCR适用于样本数量较少的情况,但需要后续的凝胶电泳和DNA序列分析。 2)RT-qPCR((R...
半定量RT-PCR参照的做法一般有两种：1) 将要比较的两个样品的BETA-ACTIN 调成一样的亮度，然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观，但较费事。2) 不进行调平，一个样品里将目的基因和BETA-ACTIN直接比较，用软件就可以做到，然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简...
RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul (浓度100ng)引物上下游各1u
RT-PCR的电泳荧光条带分析 本实验是应用于RT- PCR的电泳荧光条带分析方面。本实验所要研究的核心问题是PCR的结果如何与已知基因的DNA相对比,由此找出PCR扩增子之间的差异和缺失的基因序列,最后确定基因突变类型、位点以及进一步研究其功能的可能性等。 在生物化学中,PCR的意思是聚合酶链式反应,也就是将DNA聚合酶加...
一步法RT-PCR 10×bufferMg2+dNTPRnaseInhibitorAMVRnaseXLAMV-TaqH2O引物Ⅰ引物Ⅱ2ul4ul2ul0.4ul0.4ul0.4ul3.8ul1ul1ul RNA(≤1ug)5ul 两步法RT-PCR ComponentsRNA5xR.T.bufferdNTPs(10mmol/L)PrimerRnasin(50U/µl)AMV-RT((10U/µl)RT-PCR反应体系 Volume(µl)8(1µg)4210.41.0...
3 PCR产物电泳鉴定 1、凝胶准备 用1×TAE配制2%琼脂糖凝胶。 ①称0.8g琼脂糖置三角瓶中,加40ml 1×TAE ② 微波炉加热大约1分钟,熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时,加入EB 2μl(终浓度0.5μg/ml ),并轻轻混匀 2、铺胶:将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内,凝胶厚度3～5mm ...
(3) PCR结果 反应结束后确认RT-qPCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。5.数据分析 一般有相对定量和绝对定量两种分析方法，相对定量是检测实验组和对照组中靶基因的倍数差异，特别适合在对RNA模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，另外，相对...