PCR引物用量 一般PCR反应引物的终浓度为0.2～1μmol/L,在此范围内,PCR产物量基本相同。 但引物低于0.2 μ mol/L时,则产量降低。 引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。 结果分析 M 1 2 3 M:100bp 梯级DNA分子量标志物;泳道1:阳性对照; 泳道2:靶DNA扩增; 泳道3:阴性...
本实验是应用于RT- PCR的电泳荧光条带分析方面。本实验所要研究的核心问题是PCR的结果如何与已知基因的DNA相对比,由此找出PCR扩增子之间的差异和缺失的基因序列,最后确定基因突变类型、位点以及进一步研究其功能的可能性等。 在生物化学中,PCR的意思是聚合酶链式反应,也就是将DNA聚合酶加到含有引物的DNA上,通过聚合...
DNA的变性发生在一个很窄的温度范围,通常将DNA加热变性过程中,紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度(Tm, melting temperature),也可以简单的理解为一半的DNA解开双链。 延伸(Elongation)/终延伸:温度升高到72-80℃。在存在DNA模板 + 引物 + 2x Taqmix(老式PCR试剂被分解为:dNTPs + 酶 + MgC...
RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul (浓度100ng)引物上下游各1u
(4)电泳分析:将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳,根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。 三、实验结果与讨论 通过以上实验步骤,我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据,并进行了初步的分析和讨论。 1. RT-PCR结果分析 我们首先进行了RNA提取和逆转录反应,得到了各组织或条件下的...
25mmol/L)Volume(µl5.02.52.5 Primer1 Primer2TaqDNApolymeraseddH2OTotal cDNAPCR扩增 1 111225 DEPC-H2O Total 3.6 20 cDNA第一链合成反应 实验目的 了解RT-PCR的基本原理。熟悉RT-PCR的常规步骤。掌握琼脂糖凝胶电泳技术。实验要求 掌握PCR技术。学会操作PCR仪。熟悉琼脂糖凝胶电泳技术。
PCR条件: 94℃变性5分钟后开始以下循环 • 94℃变性反应50秒 • 58℃退火反应50秒 • 72℃延伸反应1分钟 • 进行24个循环 • 最后72℃反应7分钟 • 4 ℃冷却恒定。 3、电泳检测PCR产物 采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量(取10μl扩增产物) 、引物扩增的特异性及长度 。并可根据标准DNA的量...
五、产物的电泳和结果的测定: 根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶(不同长度产物所需凝胶浓度),取适量PCR产物,加上样缓冲液充分混合,点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中,10V/cm电泳45-60min。成像系统成像分析。 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度 ...