1RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul (浓度100ng)引物上下游各1ul (浓度10uM/L)pcr mix 10ul (用过biotek的mix,也用过takara 的EX Taq HS)rnafree水 7ul 94℃ 5min94℃ 30...
rt-pcr及其产物电泳分析20161101 RT-PCR中南大学生命科学学院实验目的u熟悉RT反应的原理;掌握RT反应的操作步骤u熟悉PCR反应的原理u掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化u掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法实验原理RT反应:在逆转录酶作用下,以mRNA为模板合成cDNA(complementaryDNA)分子的过程。PCR反应:PCR扩...
本实验是应用于RT- PCR的电泳荧光条带分析方面。本实验所要研究的核心问题是PCR的结果如何与已知基因的DNA相对比,由此找出PCR扩增子之间的差异和缺失的基因序列,最后确定基因突变类型、位点以及进一步研究其功能的可能性等。 在生物化学中,PCR的意思是聚合酶链式反应,也就是将DNA聚合酶加到含有引物的DNA上,通过聚合...
miRNA:茎环法原理:由于miRNA全部为23nt左右的短序列,无法进行直接PCR检测,所以使用了茎环序列这个工具,茎环序列是一段50nt左右单链DNA,可以自身形成发卡结构,3’末端可以设计成与miRNA部分片段互补的序列,那么在反转录时就可以将目的miRNA连接到茎环序列上,那么总长度就达到70bp,就符合qPCR确定的扩增产物的长度。加尾...
聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增长的过程,使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的...
1、DNA聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增一步法一步法ComponentsVolume(l)RNA8(1g)5xR.T.buffer4dNTPs(10mmol/L)2Primer1Rnasin(50U/l)0.4AMV-RT(10U/l)1.0DEPC-H2O3.6Total20两步法两步法ComponentsVolume(lR.T.Product5.010 xPCR buffer2.5MgCl2(25mmol/L)2.5Primer11Primer21Taq DNA polymeras...
简言之,PCR就是一个滚雪球的过程,其DNA分子数呈现出一变二、二变四的等比增长过程,理想状况下qPCR反应中的分子数如下图所示: 然而在实际情况下,随着产物数量的越来越多,缓冲液、dNTP、能量等逐渐被消耗,因而PCR产物数与循环数的关系如下图所示。 而RT-PCR就是实时检测PCR每个循环扩增产物相对的荧光信号,来实现...
PCR产物检测:琼脂糖凝胶电泳注意:电泳槽里装的电泳液是1X TAE溶液;琼脂糖凝胶泡在电泳液里,凝胶是带点样孔的,样品就点在这种点样孔里;电泳槽的一边接电源负极,另一边接电源正极,RNA或DNA带负电,会从负极跑向正极;电泳时的电压设置为恒压120V;普通rtPCR的产物长度为300-400bp,使用1.2%的胶;琼脂糖凝胶配制:...
因为cDNA是长短不一的DNA片断混合物,所以电泳的结果大多是模糊一片的,如果RNA丰度较低,电泳也可能是无产物,但是这种情况并不代表PCR会无结果。检测cDNA可以用定量的方法首先看一下内参有没有扩增出来,内参有结果,cDNA的质量基本上可以保证。但能扩增出内参,不一定就说明cDNA没有问题。因为内参在cDNA中丰度高,很容易...