在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此对模板进行定量。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。那么首先我们来看几个基本概念：基线，荧光阈值和Ct值。基线（baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即...
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子...
PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5'-3’ 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每...
RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应,是一种在DNA扩增反应中,以萤光染色剂检测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。 OK～这里对RT-qPCR的原理,应用及数据分析就不再赘述了,因为今天我们主要讲的是如何设计出...
RT-PCR引物设计原则 引物长度: 17-25bp GC含量:45-55% Tm:上下游引物Tm值相差不能太大 Oligo:63-68℃Primer3:60-65℃ 序列:碱基要随机分布,尽量均匀 避免出现GC或AT富含区(尤其3'端) 避免出现多聚嘧啶、多聚嘌呤 3'端:避免出现GC或AT富含区 3'端碱基最好是G或C最好不是T 互补:引物自身、引物之间...
实际上,在做qRT-PCR之前,我们第一个需要确定的是内参基因,根据自己实验材料和检测的基因选择好适合的内参基因后。开始为自己的片段设计引物。与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外,还需要注意以下法则:(1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
一步RT-PCR中两条引物的其中一条既应在RT中发挥作用,又应在PCR中发挥作用。为兼顾RT和PCR,引物的退火温度一 般在45~65℃之间。为增加一步RT-PCR产物的量,引物浓度可增加到0.6μmol/L。引物最好设计在离mRNA 3' 末端4 kb区域以内,扩增长度小于1.5 kb。
可以的，50bp到150bp都可以，只要你设计的引物探针特异性好，是可以做出来的；不过一般都是100bp-150bp左右比较好，我研究过中山达安公司09年的H1N1检测试剂盒，通过TA克隆得知，他们的检测H1N1病毒的H1跟N1两管混合液中扩增目的片段的长度都是70bp左右。如果你的引物探针以及合成好的了话，就做实验吧...