在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此对模板进行定量。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。那么首先我们来看几个基本概念：基线，荧光阈值和Ct值。基线（baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子...
RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中，包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。RT-PCR的方法之一步法和两步法 RT-PCR其操作方法分为两种，即一步法和两步法。一步法RT-PCR，逆转录同PCR扩增结合在一起，即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行，一步...
用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象,为了成功进行RT-PCR,需要设计多于一个反义引物,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。 提...
4. PCR程序 三步法: 第一步:94℃变性30s; 第二步(循环30-35次):94℃变性30s,55-60℃退火30s,72℃延伸24s(时间按照合成速度和长度来计算); 第三步:72℃终止延伸5-10min。 5. 引物 引物设计步骤: 找到目的基因的CDs序列(存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计);用软件设计和评价引物(Oli...
PCR扩增子长度:50-180bp 引物长度:17-25bp GC含量:45-55% Tm:58〜68℃,引物对间差异不大于2℃ 碱基要随机分布,尽量均匀。3′端要避开AT,GC rich的区域,避开T/C或A/G连续结构(2-3个)。引物自身和引物间不能存在互补。引物3’末端为G或C
可以的，50bp到150bp都可以，只要你设计的引物探针特异性好，是可以做出来的；不过一般都是100bp-150bp左右比较好，我研究过中山达安公司09年的H1N1检测试剂盒，通过TA克隆得知，他们的检测H1N1病毒的H1跟N1两管混合液中扩增目的片段的长度都是70bp左右。如果你的引物探针以及合成好的了话，就做实验吧...
扩增子长度 借助SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统中具有高持续合成能力酶的组合,可实现对多种长度靶标的扩增(图5)。只需短短 10 分钟即可合成全长 cDNA,而 PCR 步骤的延伸速度为 30 秒/kb,这使其成为各种一步法 RT-PCR 试剂盒中耗时最短的方案之一。
这种创新技术提高了cMaster RTplusPCR的灵敏度和特异性。使cMaster RTplusPCR试剂盒既能进行一步法,又能进行两步法RT-PCR,而且具有很大的动力学检测范围,能扩增得到的PCR产物长度范围也很大(一步法反应最长可扩增5.3 kb片段;两步法方案最长能扩增12.3 kb 片段)。
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染...