探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 三. RT-qPCR具体实验步骤 引物设计: 除了遵循一...
逆转录PCR, 又称RT-PCR RT- PCR, ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction, 即逆转录PCR,是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 RT-PCR原理 RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物, 利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板, 进行PC...
逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不...
引物长度为15-30bp,最常用的为23bp;引物Tm值介于62-73℃之间,上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作;3’-端的Tm值要低于5’端;引物GC含量约为40-60%;避免扩增模板的二级结构域;避免引物的二级结构;避免与靶DNA错配。 6.PCR酶:可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 7. PCR体系:...
RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应,是一种在DNA扩增反应中,以萤光染色剂检测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。 OK~这里对RT-qPCR的原理,应用及数据分析就不再赘述了,因为今天我们主要讲的是如何设计...
PCR扩增子长度:50-180bp 引物长度:17-25bp GC含量:45-55% Tm:58〜68℃,引物对间差异不大于2℃ 碱基要随机分布,尽量均匀。3′端要避开AT,GC rich的区域,避开T/C或A/G连续结构(2-3个)。引物自身和引物间不能存在互补。引物3’末端为G或C
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染...
第一链cDNA可用于第二链cDNA的合成或PCR扩增,也可以将第一链cDNA存放于-20℃备用 (2)巢式PCR反应①设立501的PCR反应体系,在0.25ml的PCR管中,分别加入: 10×PCR缓冲液 5 u cDNA模板 5ul 2.5mmol/L的dNTP混合液 1 I Taq dnA聚合酶(5Ul) 0.5gl 10mo/L的外引物(P1、P2)各1ul H2O至50ul 如果PCR仪没...
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染...
基因特异性引物通常用于一步(偶联)RT-PCR。这些方法通过将所有逆转录酶活性引导到特定的信息,而不是转录整个RNA来提高敏感性。对于目标扩增子长度约为100bp或以下的RT-qPCR应用,使用更高浓度的随机引物可能是有利的。设计跨越内含子或内含子-外显子边界的引物可以确保cDNA是由剪接的mRNA序列合成的,而不是gDNA中的...