RT-PCR就是逆转录PCR(Reverse transcription PCR)或称为反转录PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR),是以RNA为材料应用于PCR扩增中的一种实验方法。首先通过逆转录酶将总RNA或信使RNA(mRNA)转录成互补DNA(cDNA)。其次Taq DNA聚合酶以cDNA为模板进行qPCR扩增。RT-PCR已...
RT-PCR 是将 RNA 的反转录(RT)和 cDNA 的聚合酶链式扩增(PCR)相结 合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA,再以 cDNA 为模板, 扩增合成目的片段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基 因表达水平,细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆 特定基因的 cDNA 序列。 作为模板的 RNA 可以是总...
在以菌体或者细胞为PCR模板的时候,可以采用95C热变性5 min使细菌或者细胞完全破裂并释放出作为PCR模板的DNA。 第二阶段,循环反应阶段:由变性、退火、延伸三个步骤依次进行,组成一轮循环,一般需要25~30轮循环才能完成PCR扩增。 第三阶段,充分延伸阶段:72°C延伸5～10 min,使PCR产物充分延伸,进一步提高PCR的效率。
实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。① 荧光染料法（SYBR Green）：SYBR ...
扩增曲线 (Amplification curve) 是指随 PCR 反应进行，根据荧光信号强度随着循环数变化而绘制的曲线。正常的扩增曲线 (S 型) 包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。熔解曲线 (Dissociation curve) 是指随温度升高 DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。扩增子(Amplicon) 为DNA或RNA扩增后的一段...
PCR有很多种,其中RT-PCR,全称反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 实验原理是在试管内,以变性-退火-延伸三个基本反应为一个循环,反复重复这种循环,使DNA得以扩增。其目的是检测核酸的表达,主要是RNA的表达,DNA不...
逆转录RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物,利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,扩增合成目的片段,而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传...
SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统的出色灵敏度有利于低丰度靶标的检测(图2);即使 RNA 起始量非常有限,也能进行一步法 RT-PCR 扩增。 图2.从低起始量 RNA 样本中进行靶标检测。使用SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统将 1 μg UHRR 连续稀释至 0.01 p...
• 在构建(q)PCR时,选择跨越外显子-外显子接点的PCR引物,以使cDNA特异性扩增。 碰到问题:cDNA截短 可能原因:RNA完整性低 改善建议: • 合成cDNA前,通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。 • 尽量减少RNA样品反复冻融的次数,以防止降解。