TaqMan探针法则是应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物：依赖荧光能量共振传递（FRET）检测特异性扩增产物。TaqMan探针是一段长约18-24nt的核苷酸序列，它的5’端连接有一个荧光报告基团（F），3’端连接有一个淬灭基团（Q）。在非杂交状态下，荧光基团与淬灭基团距离较近，当受到照射时，荧光报告基...
1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。 2. 引物长度和Tm值:引物设计长度为18-25 bp,Tm值...
对于QPCR来说,一般设置产物扩增片段长度为70-200 bp较为合适。 上图中,大家有没有看到最下面那个框框,是可替换的引物对数,这个软件的好处是会自动对其所设计的引物进行排序,按分值从高到低排序,一般软件会默认可替换对数为5对。 OK～都设置完了,点击sea...
1、如果模板为真核生物来源,且后期cDNA用于常规PCR扩增,建议选择Oligo(dT);若后续实验仅用于qPCR,建议将Oligo(dT)与随机引物混合后使用,可提高反转录效率。 2、如果模板为原核生物来源,反转录请选用Random Primers 或者基因特异性引物。 荧光定量 荧光定量主要从定量方法的选择、引物设计原则、ROX的选择、反应体系的...
实际上,在做qRT-PCR之前,我们第一个需要确定的是内参基因,根据自己实验材料和检测的基因选择好适合的内参基因后。开始为自己的片段设计引物。与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外,还需要注意以下法则:(1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子...
可以的，50bp到150bp都可以，只要你设计的引物探针特异性好，是可以做出来的；不过一般都是100bp-150bp左右比较好，我研究过中山达安公司09年的H1N1检测试剂盒，通过TA克隆得知，他们的检测H1N1病毒的H1跟N1两管混合液中扩增目的片段的长度都是70bp左右。如果你的引物探针以及合成好的了话，就做实验吧...
7. PCR 反应体系的配制在冰上进行, 最后加 TAq 酶, PCR 结束后, 产物勿放置在室温下过长时间, 有人认为室温下有些 TAQ 酶会将多余的引物合成为二聚体; 8. 增加循环数; 9. 降低退火温度后有条带, 则应逐渐提高温度, 若提高温度的同时产物量减少, 则考虑增加镁离子浓度,根据扩增片断长度而定, 片段长则...
这种创新技术提高了cMaster RTplusPCR的灵敏度和特异性。使cMaster RTplusPCR试剂盒既能进行一步法,又能进行两步法RT-PCR,而且具有很大的动力学检测范围,能扩增得到的PCR产物长度范围也很大(一步法反应最长可扩增5.3 kb片段;两步法方案最长能扩增12.3 kb 片段)。