PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长度。循环次数一般为20-45次,PCR扩增效率呈S形曲线状,平台出现的早晚与模板初始量有关,另外还与许多因素有关:如引物二聚体和反应亚产物(焦磷酸等)的产生抑制了扩增反应、反应体系中各组分的消耗和变性、引物和产物间的竞争(反应产物之间杂交,反应产物与模板的杂交甚...
扩增效率肯定是在(1,2)之间,理想状态下才是2,而理想状态通常是不存在的。这个模型的假设点其实是treatment组和control组的扩增效率一样,至于是不是2,比2小多少,并不影响后续的统计分析。 Data 我们来看以下一份数据,4组重复实验,用RT-PCR测了gene01和gene02的表达量,HK代表house keeping gene,即参照。以下数...
7、RT-qPCR扩增效率 PCR的效率取决于许多因素,既存在抑制剂也存在增强剂,如下图所示。在所有比较样品中稳定和恒定的扩增效率是样品之间实现可靠比较的一个重要标准。 一种有效的用来确定 qPCR 实验是否是最优化的方法:将模板稀释成一系列浓度梯度进行 PCR 反应,用...
扩增效率。PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1。但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.
一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想...
PCR的效率应当在90-110%之间(3.6 > 斜率 > 3.1)。有一系列变量会影响到PCR的效率。举例来说,这些因素包括扩增子的长度、二级结构以及引物设计等。尽管扩增效率落在上述范围之外时,我们也可以得到有效数据,但是仍然应当对qRT-PCR进行进一步优化或改变扩增子设计。
基线（baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线。阈值（threshold）：阈值一般是基线的标准偏差的10倍，在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct 值（Ct value）：Ct值就是荧光值达到阈值时候的...
3、扩增效率及相关系数 斜率:由荧光定量PCR反应的数学原理可知,通过绘制标准曲线可评估PCR反应的扩增效率。为了正确地评估PCR扩增效率,至少需要做3次平行重复,并至少做5个数量级倍数连续梯度稀释模板浓度。得到的扩增效率在90-110%之间时,认为此扩增接近理想情况,数据可以用来计算。此...
在进行qRT-PCR前,建议大家最好进行预实验测定引物的扩增效率,正常情况下,扩增效率E在90%-110%之间,超过这个范围,很可能会极大程度影响你最后相对表达量的结果。 通过10倍稀释对样品进行多次梯度稀释,使用稀释样品,进行qPCR扩增获得Ct值,最后根据各样品浓度及相应的Ct值绘制标准曲线,即可得到线性方程,并最终计算出扩增...