1从供体生物特定分化型组织或细胞中提取纯化总RNA,其中目的mRNA为高丰度mRNA;2以Oligo(dT)为引物,以总RNA中的总mRNA为模板,在反转录酶作用下合成互补的总cDNA;3变性:升温至94~95°C加热5min,使总mRNA : cDNA的杂交链由于热变性而分开成单链;4退火:降温至40~60°C,加入“上游”寡核苷酸引物和“下游”寡核苷...
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。合成cDNA引物的选择是分子生物学实验中的一项关键步骤，它直接...
qPCR引物设计流程与普通PCR一致,但相较于普通PCR的引物设计原则,qPCR更为严格,具体如下:1. 引物的退火温度要高,一般要在60℃以上;2. 引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可; 3. 对于定量PCR来说,特别是在使用SYBR Green的情况下,引物二聚体的存在对结果的干扰较大,所以在选择引物时要尽量避免容易...
①一步法RT-PCR使用基因特异性引物,对模板RNA质量要求较高,RNA质量的优劣严重影响逆转录效率。 ②两步法RT-PCR的RT过程使用Oligo dT和Random Primer最适比例混合液作为引物,就反转录产量和效率而言,一步法RT-PCR使用的基因特异性引物低于Oligo dT和Random Primer。 ③Reverse Tranase最适酶活温度多为37-50℃,而...
逆转录RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物,利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,扩增合成目的片段,而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传...
逆转录RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物,利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,扩增合成目的片段,而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传...
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。 材料及试剂耗材 ...
逆转录RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物,利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,扩增合成目的片段,而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传...
2、合成cDNA引物的选择 一步法 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。RT-PCR引物的选择: 1. 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR...