(2)实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT-PCR,RT-qPCR) 实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT-PCR,RT-qPCR)是qPCR和RT-PCR的组合,所以RT-qPCR(也有人写成qRT-PCR)是结合了荧光定量技术的反转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析(RT-PCR只可以定性...
RT-PCR) 可使用 RNA 作为模板生成互补 DNA (cDNA)。利用逆转录酶，产生 cDNA 的单链拷贝。然后，这...
2.2 PCR技术:即聚合酶链式反应 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促反应,其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步: A.变性:通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA; B.退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结合。 C.延伸:在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下...
用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象,为了成功进行RT-PCR,需要设计多于一个反义引物,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在...
【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应(Reverse Transcription,RT)产生cDNA 第一链,再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3
所以PCR反应开始,探针游离于体系中完整存在时,报告荧光基团并不会发出荧光,当退火时,引物和探针结合于模板,在延伸阶段,聚合酶不断的合成新链,由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性,到达探针时,DNA聚合酶就会将探针从模板上水解下来,报告荧光基团和猝灭荧光基团分开,释放荧光信号。由于探针和模板存在一对一的关系,...
检测基因在转录⽔平的表达，需检测 mRNA 含量，定量 RT-PCR 是主要⽅法之⼀。实验基础：酸性酚法；四步骤（组织或细胞匀浆、分离总 RNA、纯化 RNA、检测 RNA 的纯度及完整性）酸性酚法：在酸性条件下苯酚可溶解 DNA ⽽不溶解 RNA，同时酚⼜是蛋⽩变性剂。利⽤酸性酚试剂加氯仿共抽提，可⼀步完成...
在IVD领域中应用：在临床检验的PCR试剂中含有UDG酶/HL-UDG酶，以防止污染。UDG酶 HL-UDG酶 RNase抑制剂 定义：该酶是在大肠杆菌中表达纯化的重组鼠源RNase抑制剂，可通过非竞争方式1:1与RNase A、B或C结合，从而抑制三种酶的活性。作用：保护RNA不被降解。在IVD领域中应用：在RT-PCR、RT-qPCR检验中，能与...
RT-PCR中引物的选择指南