1. Total RNA was extracted using a Trizol reagent (Invitrogen). RNA (2 μg) was converted into cDNA using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo). QRT-PCR was accomplished using the FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche) in the ABI PRISM® 7300 real-time PCR...
RT-PCR实验过程及需要试剂耗材 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。试验前注意：1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的...
4.PCR扩增:将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。 5.分析产物:将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析,以检测和定量RNA的表达水平。 注意事项 在进行RT-PCR实验时,有几个注意事项需要遵守: 6.RNase污染:RNase是一...
Real Time PCR : 1.反应体系的配制 本实验室用的是大连宝生物的产品:TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus), Bulk。 这个试剂盒是采用嵌合荧光检测法,TB Green 与双链 DNA 结合后发出荧光,所以可以通过检测反应体系中的 TB Green 荧光强度,达到检测 PCR 产物扩增量的目的。具体原理见下图。
RT-PCR实验步骤 一、组织抽提: 1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末 2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆 3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打 4. 冰上孵育5分钟 5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
实验步骤 一、总RNA的提取 总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高质量的总RNA;(2)可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR和阵列分析所需。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preampli...
下面是RT-PCR的具体步骤: 1.提取RNA:首先从样本(可以是细胞或组织)中提取RNA。这可以通过商业RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿提取法来完成。提取的RNA可能含有DNA杂质,因此可以使用DNA酶I来去除DNA。 2.逆转录反应:将提取的RNA转录成互补的DNA(cDNA)的过程称为逆转录。逆转录反应的目的是将RNA转录成cDNA,并将其...
RT-PCR全过程步骤 一.试剂材料准备 1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等) 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管) 2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净...