1.了解用逆转录RT-PCR法获取目的基因的原理。 2. 学习和掌握逆转录 PCR 的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应PCR过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增长的过程,使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。 一般...
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR...
三、RT-PCR步骤: 1、RNA的提取: 2、cDNA的合成: 逆转录体系的组成: 3、PCR扩增: 50ul PCR体系的组成: 4、PCR反应条件: 5、PCR条件的优化: PCR条件的优化主要是 ①引物退火温度的调节,一般在引物设计软件推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。 ②此外Mg2+浓度的调节也非常重要,通常最佳浓度为2 mM左右。
RT-PCR实验原理: RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法,它由两大步骤组成:一步是反转录(RT),另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后,即可进行RT-PCR。首先,在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA,以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增,根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物,基因...
PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物...
RT-PCR实验通常包括以下步骤: 2.1 •收集所需的细胞或组织样品,并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。 •如果需要,使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。 2.2 •准备RT-PCR反应体系,包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。 •混合反应液,然后进行逆转录反应。此步骤通常在反应器中以特定温度...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...