实时定量PCR(RT-qPCR)实验操作流程 一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,...
PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5'-3’ 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每...
(4)可能原因:反应体系中存在 PCR 反应抑制剂。 解决方案:加大模板稀释倍数或重新制备模板重复实验。 (5)可能原因:cDNA 模板浓度低。 解决方案:减少稀释度重复实验 4.内参基因 Ct 值正常,目的基因 Ct 值出现较晚 (1)可能原因:目的基因表达量偏低。 解决方案:重新富集 RNA。 (2)可能原因:目的基因引物扩增效率...
96 或 384多孔板等 2.实验操作流程 反转录反应 Q-PCR 扩增 三、实验步骤 反转录反应 配置Template primer mix RNA 变性及反转录 2.Q-PCR 扩增 配置PCR反应体系 设置并运行 PCR 程序 3.程序设定 在LightCycler® 480 软件中设置反应程序 样品编辑与结果分析 实验结束后,进行样品编辑和数据分析 四、疑问解答 ...
使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验是一个复杂但精确的过程,涉及多个关键步骤。以下是一个详细的实验流程,旨在指导如何正确使用该试剂盒进行RNA的检测和定量分析。 一、实验前准备 1.了解试剂盒信息:首先,仔细阅读试剂盒的说明书,了解试剂盒的组成、储存条件、有效期以及实验所需的设备和试剂。
实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 实验步骤来源:上海抚生实业有限公司 2024年09月29日 14:23 分享 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针,当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号,从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR ...
一、RT-PCR操作步骤 RNA抽提 方法：TRlzol法。主要成分：苯酚（具有裂解细胞和变性蛋白的作用）。RNA抽提...
在RT-PCR过程中,通过反转录酶将RNA转化为cDNA,再利用特定的引物和荧光探针进行PCR扩增,从而实现对目标RNA的定量分析。实时定量RT-PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和高准确性,能够实现对RNA样本的精确定量分析。 在实时定量RT-PCR的实验方法中,样本处理、反转录、PCR扩增和数据分析等步骤均至关重要。优化样本处理...
PCR实验方法步骤: RT-病毒探针法荧光定量PCR试剂盒方法 1:在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mix (2mM) 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10pM) 2μl Taq酶 (2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖...