答:原理:即逆转录PCR,先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成DNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。这样低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法,可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。 RT-PCR过程:1、mRNA,引物和逆转录酶以及适当的缓冲体系在70C5...
原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。 逆转录酶(reverse transcriptase)是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性: (1)依赖RNA的DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成...
①原理:RT-PCR为逆转录PCR或者称反转录PCR,是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 ②过程:预变性,破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构,使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于...
【实验步骤】 1. 反转录反应 1) 按下列组成配制反转录反应液 MgCl2 2ul 2. PCR 反应 1) 按下列组成配制PCR 反应液 2) 把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中,轻轻混匀; 3) 按以下条件进行PCR 反应:94 ℃ 2 min,94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles,72℃ 5 min...
PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物...
1.了解用逆转录RT-PCR法获取目的基因的原理。 2. 学习和掌握逆转录 PCR 的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应PCR过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增长的过程,使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
RT-PCR实验通常包括以下步骤: 2.1 •收集所需的细胞或组织样品,并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。 •如果需要,使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。 2.2 •准备RT-PCR反应体系,包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。 •混合反应液,然后进行逆转录反应。此步骤通常在反应器中以特定温度...
实验步骤 一、总RNA的提取 总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高质量的总RNA;(2)可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamp...