答:原理:即逆转录PCR,先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成DNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。这样低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法,可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。 RT-PCR过程:1、mRNA,引物和逆转录酶以及适当的缓冲体系在70C5...
接头可以是在 PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段,经PCR扩增后,再克隆入相应的载体,也可以利用末端转移酶,在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC 或 dT和dA 尾巴, 退火后形成重组质粒, 并转化到宿主菌中,进行扩增。 本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas配体基因。Fas配体(FasL)是一分子量约为40u的II...
PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物...
RT—PCR原理与实验步骤 一、知识背景: 1、基因表达:DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA(每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白)共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction):...
实验步骤 一、总RNA的提取 总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高质量的总RNA;(2)可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamp...
RT-PCR原理及方法 09-10-15 精选2021版课件 1 背景 基因的表达 基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物 不同细胞或组织表达不同的基因 精选2021版课件 2 目的 通过反转录(reversetranscription,RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的方法,检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平...
RT-PCR实验通常包括以下步骤: 2.1 •收集所需的细胞或组织样品,并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。 •如果需要,使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。 2.2 •准备RT-PCR反应体系,包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。 •混合反应液,然后进行逆转录反应。此步骤通常在反应器中以特定温度...
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶。在完成逆转录过程之后，通过PCR进行定量分析的时候，随着技术的...