7.预变性5min足够了,循环中的变性以你的产物长度来说30s也够了,不过不放心可以改啊,条件是摸索出来的嘛. 最后总结:我觉得引物第一,模板第二,其他神马的只要按PCR的规则随便都可以做出来,做得好不好看而已,你有没有考虑过模板物种问题?是不是没混匀?机器问题?上样问题?试剂存放时间问题,我觉得做不出来要细心...
RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现的中转站,所以我们要把微量的信使RNA弄出来,更重要的是,RNA太容易分解了,环境中无处不在的RNA酶,以及其容易被水解的特点啊,我们不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式,于是就有...
③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较,PCR产物的长度是否正确。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。 RT-PCR检测人β-actin基因表达 扩增产物长度 260 bp 问题及解决方法 无PCR产物 1. 确保mRNA无降解。 2. 确保酶未失活。 3. 确保引物无降解。 4. 重新设置退火温度。 5. 重新设置变性...
实时PCR(RT-PCR)是一种使用荧光染料或探针(实验室通常称为引物)技术对样品中存在的核酸进行定量的技术或实现靶基因/序列的扩增。RT-PCR足以扩增目标或模板DNA (cDNA是其中一种),也就是说,它可以在PCR仪器(热循环仪器)复制DNA。它使我们能够研究目标序列或基因,因此一直是遗传学中的一项关键技术。 (图3 RT-PCR...
1 RT-PCR 中南大学生命科学学院 2 熟悉RT反应的原理;掌握RT反应的操作步骤 熟悉PCR反应的原理 掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化 掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法 3 RT反应:在逆转录酶作用下,以mRNA为模板合成cDNA(complementaryDNA)分子的过程。 PCR反应:PCR扩增是模拟天然DNA复制过程,利用DNA...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
在生物化学中,PCR的意思是聚合酶链式反应,也就是将DNA聚合酶加到含有引物的DNA上,通过聚合酶的作用使单链DNA断裂成为具有一定长度和一定碱基序列的DNA片段,这些片段被不同特异性的酶切割并连接起来形成扩增产物,然后再经过电泳检测产物的荧光强度,根据产物的荧光强度,从而判断是否存在突变或者基因的缺失等信息。 在生物...
7.预变性5min足够了,循环中的变性以你的产物长度来说30s也够了,不过不放心可以改啊,条件是摸索出来的嘛.最后总结:我觉得引物第一,模板第二,其他神马的只要按PCR的规则随便都可以做出来,做得好不好看而已,你有没有考虑过模板物种问题?是不是没混匀?机器问题?上样问题?试剂存放时间问题,我觉得做不出来要细心...
解析 检验一下产生的扩增后的片段的长度和浓度~要是片段长度为目的片段长度或者相差不多的话,就说明扩增成功了~有的时候扩增完电泳会发现片段长度与目的基因的差了好多,那就是有问题啦~而且有的时候还会出现多条带等等情况,就都是出问题的体现~应该查一查引物设计等等方面~...
25mmol/L)Volume(µl5.02.52.5 Primer1 Primer2TaqDNApolymeraseddH2OTotal cDNAPCR扩增 1 111225 DEPC-H2O Total 3.6 20 cDNA第一链合成反应 实验目的 了解RT-PCR的基本原理。熟悉RT-PCR的常规步骤。掌握琼脂糖凝胶电泳技术。实验要求 掌握PCR技术。学会操作PCR仪。熟悉琼脂糖凝胶电泳技术。