7.预变性5min足够了,循环中的变性以你的产物长度来说30s也够了,不过不放心可以改啊,条件是摸索出来的嘛. 最后总结:我觉得引物第一,模板第二,其他神马的只要按PCR的规则随便都可以做出来,做得好不好看而已,你有没有考虑过模板物种问题?是不是没混匀?机器问题?上样问题?试剂存放时间问题,我觉得做不出来要细心...
RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul (浓度100ng)引物上下游各1u
1、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) Real-time-PCR 和 qPCR 是一码事。实时荧光定量PCR,也叫Real-Time PCR,即二代PCR,是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团,在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化,最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。
对于极低表达丰度的目标,一轮PCR很有可能得不到产物,这是建议使用NESTED PCR,就是设计2套嵌套的引物,第一轮先用外面的那对,理论上可以得到一个比较大的产物(跑胶不一定能看到),然后稀释PCR产物50倍,再用里面那对引物扩一次,一般可以得到跑胶看得见的产物量。3. 关于引物设计,推荐使用Primer...
内参扩增好,目的条带不好大多数是扩增条件不合适或者引物设计不合适。cDNA模板过多或者过少都会影响PCR扩增,很多同学担心自己的cDNA浓度低,实际上好多时候cDNA浓度过高也会影响PCR扩增。你可以做一组梯度,比如原液,稀释2倍,稀释4倍的试一下。如果真的是cDNA浓度太低,而且你的基因本身拷贝数也比较少...
电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix在扩增结束后可以直接上样,不需要另外再加 loading buffer。PCR 产物阳性对照必须有预期条带出现,阴性对照必须无任何扩增,否则实验无效。对没有扩增产物的样品,可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除 PCR 抑制剂的感染。 PCR常见问题的常见原因 1. cDNA产量的很低可能的...
原因很多,可能是提取过程中,RNA降解了,也可能是你的反转录不成功,扩不出来;也有可能是你的循环数太少了
1.普通 PCR 普通PCR即一代PCR,使用普通PCR扩增仪扩增靶基因,并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。 优点:经典方法,国际和国内标准齐全;仪器试剂成本较低;PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验; 缺点:容易污染;操作繁琐;只能定性分析;敏感性中等;存在非特异性扩增,当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分;...
说个小窍门:样品作一系列的稀释,然后每份取1ul点到一块凝胶上,稍等片刻吸收后,不要电泳,直接EtBr染色。根据亮度再进行一次细微的稀释调整。