1实验目的:构建hsa_circ_0007142全序列载体, 并以hsa_circ_0007142质粒全长序列为模板PCR扩增获取含有T7 promoter序列的正义链和反义链DNA,作为体外转录制备RNA pull down探针的模板。 2实验材料 l 主要试剂 l 主要仪器及器材 3基因及载体信息 基因名称:hsa_circ_0007142 基因长度:427 nt l >hsa_circ_0007142|...
RNA pulldown的原理是用生物素标记RNA模拟目的RNA与蛋白直接孵育结合,这就要求探针序列要与目的RNA序列一致,用circRNA接头互补探针做RNA pulldown不符合实验原理。 实验操作上,首先用circRNA接头互补探针的目的是拉取内源circRNA,但此时孵育温度不确定,与RNA pulldown的孵育温度不相符,另外探针-磁珠复合物与细胞全蛋白孵...
详细实验操作步骤:探针法RNA pull-down,这样做!, 视频播放量 3317、弹幕量 1、点赞数 70、投硬币枚数 11、收藏人数 206、转发人数 28, 视频作者 金开瑞生物, 作者简介 实验问题咨询及生物类合作咨询:13343461158; 蛋白抗体、检测分析/分子互作、基因/引物合成各生物领
所以pull-down实验一般是体外转录得到目的RNA。 RNA在转录出来后,其OD一般都不高,可以使用吗?咋定量呢? 一般会进行电泳检测(DNA电泳方式一样),可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。Pull-down实验不需要精确的定量,都会加入过量的探针。 关于样本处理:细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有RNA酶抑制剂这些处理...
RNA pull-down 第一天——生物素探针标记RNA 1.前期准备:取出Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit,将试剂盒中的PEG及DMSO置于常温,其余组分置于冰上融化,也可将PEG放于37摄氏度融化;打开PCR仪; 2.依照RNA母管含量,用DEPC水溶解RNA,我们通常是10ug/管,用10μl DEPC水溶解。同时溶解试剂盒中Control...
Pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull down是使用体外转录法标记生物素RNA探针,然...
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通...
二、RNA pull-down实验常见问题与处理方法 问题1:RNA降解 可能原因: 1)无核酸酶的环境被破坏 2)体外转录的RNA探针降解 解决方法: 1)清洗和使用新开的离心管和试剂等 2)RNA探针合成后,电泳检测其长度和浓度 问题2:RNA结合蛋白的亲和力不够: 可能原因: ...
(1)生物素标记RNA可使用体外转录试剂盒进行反应获取生物素标记的RNA。以上述DNA为模板,按照自备的RNA体外转录试剂盒说明书配置反应体系,以Invitrogen 货号为AM1344 的T7体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE® Kit 为例,配置以下体系: 37℃孵育2 h,再加入1 μL DNase I,37℃孵育15 min将DNA模板消化,得到正义和反...