将含有洗脱m6A RNA的上清收集到新的试管中,用苯酚:氯仿:异戊醇(125:24:1)进行纯化; 3. 文库构建: 用SMARTer® Stranded Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input Mammalian User Manual根据说明书对IP与Input样品进行反转录及文库构建;利用AMPure XP bead进行片段大小选择,获得最终文库。 构建原理图如下: 图3:富...
RNA免疫共沉淀—RIP-seq(RNA Immunoprecipititation)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,RIP利用目标蛋白的抗体将相应的RNA-蛋白复合物(RBP)沉淀下来,分离纯化捕获的RNA,结合高通量测序技术对目标RNA进行测序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,蛋白结合对象为RNA,RIP-seq即对富集得到的...
RNA免疫共沉淀—RIP-seq(RNA Immunoprecipititation)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,RIP利用目标蛋白的抗体将相应的RNA-蛋白复合物(RBP)沉淀下来,分离纯化捕获的RNA,结合高通量测序技术对目标RNA进行测序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,蛋白结合对象为RNA,RIP-seq即对富集得到的...
IP与Input比较可判断IP效率(是否有效富集),IgG做阴性对照可判断IP的特异性(是否为特异性富集)。经过这些对照层层把关,RIP实验、RIP-seq的结果才能更有保障、更加高质、可靠。 WB质检结果展示 文库质检结果展示 2.Peak Calling锁定目的蛋白结合的RNA IP富集的RNA就是目的蛋白结合的RNA了? 并不是,或者说并不完全是。
RIP、RIP-seq或RNA免疫沉淀、RNA免疫沉淀测序是一种高通量实验技术,用于研究RNA和RNA结合蛋白之间的相互作用。它允许识别细胞或组织内的特定RNA结合蛋白。 为什么研究RNA修饰是有益的? 研究RNA修饰对于解开RNA生物学的复杂性,理解基因表达调控,破译疾病机制以及探索诊断和治疗应用至关重要。它提供了对RNA分子及其在细胞...
RNA-seq的发展和进步一直离不开技术发展的支持(湿实验方面和计算分析方面),且与先前的基于基因芯片的技术比起来,获得的信息更多、偏好性更小。到目前为止,已从标准的RNA-seq流程中衍生出多达100种不同的应用。大部分应用都是基于Illumina short-read测序,但最近基于long-read RNA-seq和direct RNA sequencing (dRNA...
acRIP-Seq的结果阐述了NAT10调控mRNA乙酰化修饰的位点以及其所识别的Conserved Motif。RNA-Seq和acRIP-Seq的联合分析,分别筛选出了受NAT10敲除影响的504个,和547个下游候选基因。由此,作者检索到了下游调控疾病发生的关键基因簇,其中PTX3。经过RIP验证后,作者发现NAT10通过调控PTX3 mRNA的乙酰化修饰,提高mRNA的稳定...
早期的RNA-seq实验从细胞群(如来源于某个组织或器官的细胞)中得到DGE数据,并可以应用于很多物种,如玉米(),拟南芥(),酿酒酵母(),鼠()和人()。虽然RNA-seq这个词通常包含很多不同的RNA相关的方法或生物应用,但DGE分析始终是它的主要应用(表1),并且是DGE研究的常规工具。
一、为什么要做RNA-seq 先说下生物体内RNA的大致组成: 编码RNA:根据中心法则我们知道,DNA转录为mRNA,mRNA通过tRNA翻译为蛋白质,蛋白质行使生命功能,例如呼吸,运动,消化等等。人类只有2万左右个蛋白质编码基因,这些编码基因只占人类全基因组的2%左右。mRNA占细胞RNA总量的2%～5%, tRNA占细胞RNA总量的15%左右。
RNA结合蛋白免疫共沉淀测序技术(RIP-Seq)是研究细胞内RNA与其结合蛋白情况,了解转录后调控网络动态过程的前沿技术。其主要是利用针对特定蛋白的抗体对对应的RNA-蛋白质复合物进行沉淀,再分离复合物后提取结合在复合物上的RNA,并对其进行测序,分析和验证。RIP-Seq可用来了解不同样品中与特定蛋白结合RNA的整体水平,探究结...