自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此可利用WB检测LC3-II/I比值的变化以评估自噬的强弱。此外自噬衔接物如sequestosome 1（SQSTM1，也称为p62）也可用于检测自噬，p62蛋白水平的多少与自噬强弱有着反比例关系。2.3荧光蛋白标记检测 2.3.1 GFP-LC3 ...
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有:通过western blot检测LC3的剪切;通过电镜观测自噬体的形成;在荧光显微镜下采用GFP(-RFP)-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多,针对于此我们汉恒生物科技(上海)有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒,mRFP...
本实验中,稳定表达RFP-GFP-LC3质粒的大鼠胰岛细胞株的成功构建不仅解决了传统自噬检测手段———细胞免疫荧光技术需要相应一抗/二抗的孵育、实验成本较大、步骤繁琐耗时的缺点[24],而且为自噬在糖尿病的相关研究提供了细胞平台,有利于自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,为糖尿病药物的开发提供了便利。参考文...
1 μM Obatoclax处理K1细胞24h后，GFP-RFP-LC3阳性自噬斑点显著增加；TEM观察表明(图B)，Obatoclax处理后，K1细胞出现与溶酶体共定位的自噬囊泡形成，并且损伤的溶酶体或大泡明显增加，间接表明Obatoclax中和了溶酶体。
英文名称:pMRX-IP-GFP-LC3-RFP-LC3ΔG哺乳自噬质粒 保质期:3个月/12个月以上 保存条件:-20℃/-80℃ pMRX-IP-GFP-LC3-RFP-LC3ΔG哺乳自噬质粒信息 规格:2ug 保质期:3个月 保存温度:-20℃ 使用说明1、收到质粒干粉后请5000rpm离心1min,再加入20ul ddH2O溶解质粒 ...
方法 构建含 RFP-GFP-LC3 基因的慢病毒重组质粒载体,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染 HEK293T 细胞,收集病毒上清后感染 RAW264. 7 细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达 RFP-GFP-LC3 的RAW264. 7 细胞株,用荧光显微镜和流式细胞术分析感染效率。饥饿处理稳定感染细胞,荧光显微镜下观察 RFP-GFP-LC3 斑点。结果 ...
自噬流目前常用的检测方法有GFP-LC3-RFP-LC3ΔG。GFP-LC3在自噬溶酶体中很不稳定，而RFP-LC3ΔG则仍可以留在细胞质中，同时观察两种荧光颜色，可以用于监测自噬通量。但是上述这种方法由于需要转染质粒，一方面实验操作麻烦，另一方面也在部分实验中备受限制。之后会为大家详细介绍一种无需转染的自噬流检测方法。通过...
质粒名称: pMRX-IP-GFP-LC3-RFP-LC3ΔG 出品公司: Addgene 目录编号: 84572 存储实验室: Noboru Mizushima 载体骨架基本信息 载体名称: pMRX-IP 载体出品公司: -- 载体抗性: 氨苄青霉素 空载体大小: 6100 bp 完整质粒大小: 8300 bp 载体修饰: -- 载体类型: 哺乳动物表达,逆转录病毒 筛选标记: 嘌呤霉素 ...
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无自噬时,RFP-GFP-hLC3融合蛋白弥散在胞浆中,在荧光显微镜下显示为黄色斑点;自噬形成时,由于自噬小体进入第二阶段后,与溶酶体进行融合,形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境,可以导致PH下降,GFP淬灭,因此,GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度,GFP越少,则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越...