因此要准确分析自噬活性，就必须评估自噬的动态变化，即“自噬流”（Autophagic Flux）。自噬流目前常用的检测方法有GFP-LC3-RFP-LC3ΔG。GFP-LC3在自噬溶酶体中很不稳定，而RFP-LC3ΔG则仍可以留在细胞质中，同时观察两种荧光颜色，可以用于监测自噬通量。但是上述这种方法由于需要转染质粒，一方面实验操作麻烦，另一...
mRFP-GFP-LC3是研究细胞自噬最常用的工具之一，在mRFP-GFP-LC3的基础上汉恒生物研发出了AAV-LC3工具，可实现在体自噬监测。后续还研发出了可定位细胞器的自噬研究工具，其原理是用细胞器-RFP（红光）和LC3-GFP（绿光）分别标记细胞器和自噬小体，实现两者的共定位，例如线粒体定位的RFP（mito-RFP）、高尔基体定...
细胞内表达的GFP-LC3-RFP-LC3ΔG融合蛋白经Atg4内肽酶加工，断裂成GFP-LC3和RFP-LC3ΔG，后者缺乏与膜结合所需的C末端甘氨酸。GFP-LC3和RFP-LC3ΔG分别充当自噬底物和内对照。GFP-LC3相对于RFP-LC3ΔG的比值与自噬强弱呈负相关。这种方法可以使用流式细胞仪或荧光酶标仪检测自噬。2.3.4 Keima Keima是一种独...
自噬病毒工具，便于直接感染目的细胞后直观地观察细胞自噬的整体水平。自噬单荧光标记慢病毒 吉满自主研发出单荧光(绿光或红光)标记的自噬指示产品，当细胞内没有自噬发生时，荧光-LC3融合蛋白会均匀地分散在细胞质中，一旦细胞发生自噬活动，荧光-LC3融合蛋白就会聚集并转位到自噬体膜，此时在荧光显微镜下可清晰地观察到...
双荧光穿梭质粒系统检测 自噬形成时,mRFP-GFP-LC3质粒转移至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。 当自噬溶酶体形成后,酸性环境使GFP荧光淬灭,GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体,即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感,当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光;...
这可能是由于目前缺少检测斑马鱼体内自噬的工具 所致。为了进一步在活体中研究斑马鱼的自噬,我们培育了转基因的GFP-Lc3 和GFP-Gabarap的斑马鱼。 结果 斑马鱼Lc3是在胚胎发生的咽胚期由II转化来的 酵母Atg8蛋白及其在哺乳动物中与之同源的LC3是发生中的吞噬泡和发育 完成的自噬体的特异性标记物。GABARAP是哺乳动物中...
以下是mRFP-GFP-LC3自噬评判标准: 自噬囊泡膜的形成:正常情况下,细胞内的mRFP-GFP-LC3表达时呈现为一个均匀分布的绿色荧光信号。当自噬过程发生时,mRFP-GFP-LC3会在囊泡膜上形成点状或环状的荧光信号。观察细胞中是否出现这些点状或环状的信号,可以评判自噬囊泡膜的形成。 自噬囊泡膜的积累:正常情况下,自噬囊泡...
这两种蛋白与酵母Atg8蛋白分子相比表现出高度的同源性(Lc3为32%,Gabarap为52%)。 为了确定在胚胎发育的何时自噬被诱导发生,我们首先用RT-PCR的方法分析了Lc3和Gabarap的时间表达特异性。在卵裂的早期(1-2细胞期,受精后0小时)就可以检测到lc3和gabarap转录本(图2A),这提示lc3和gabarap的mRNA在卵细胞中就已经存在...
手段有:通过westernblot检测LC3的剪切;通过电镜观测自噬体的 形成;在荧光显微镜下采用GFP〔-RFP〕-LC3等融合蛋白来示踪自噬 体形成以与降解。近几年对自噬流的研究日趋增多,针对于此我们汉 恒生物科技〔XX〕XX自主研发了用于实时监测自噬(流)的 mRFP-GFP-LC3腺病毒,mRFP用于标记与追踪LC3,GFP的减弱可指示 ...
一、LC3-GFP质粒的构建方法 LC3-GFP质粒的构建通常是将LC3基因与GFP基因连接在一起,然后将其插入到适当的载体中,如质粒。具体步骤如下: 从细胞中提取LC3基因和GFP基因的DNA序列。 将LC3基因和GFP基因连接在一起,形成LC3-GFP融合基因。 将LC3-GFP融合基因插入到适当的载体中,如pEGFP-C1质粒。 将构建好的LC3-GFP...