分别种两小皿(3.5cm)细胞,一皿加药,另外一皿加对照。处理一段时间之后,分别收细胞提RNA,逆转录,然后准备做qPCR,这个时候我们需要做的qPCR孔如下: 注意这里面要区别一个概念是“独立实验重复”和“PCR重复”,上面p53和GAPDH都有三个PCR孔,这是PCR重复,...
实时定量PCR也被称为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。基本原理 在学习实时定量PCR数据处理之前，我们首先需要了解一下它的数学原理，Ct值为什么是我们数据处理过程中...
qPCR扩增曲线异常结果分析 在qPCR的实验过程中,不论是“新手”还是“老手”或多或少都会遇到扩增曲线异常的情况,给结果判读带来很大的困扰。异常曲线的出现可能是单个的原因(这种情况通常对单一因素调整后就会变为正常),也有可能是多个原因综合影响导致而成的,这时就需要仔细分析,控制变量进行重复验证。 对于异常曲线的...
目标基因的qPCR产物长度越长、GC含量越高,Tm值越大。不同的qPCR产物因其长度与GC含量不同,它们的Tm值大小也不一样。 根据此原理,我们可以知道。如果qPCR扩增体系不特异,出现一个非特异性扩增产物,qPCR最终的产物由目的产物+非特异性产物共同构成,因两者长度与GC含量不同,在融解曲线上会表现出两个Tm值,即两个波...
•溶解曲线,是qPCR结果判定的第一要素。它的作用是判定目的基因是否得到扩增。理论上,当反应体系中仅是目标基因的扩增,才是有效扩增。 •标准曲线,是qPCR结果判定的金标准。(在溶解曲线判定为特异性扩增后)它的作用是测定引物的扩增效率及试剂的检测上下限。根据文章发表对于qPCR数据的要求,扩增效率应在90-110%。
qPCR已经应用于生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析, SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。qPCR 扩增的速率就是简单的指数增长,数学形式就是 2 的 Ct 次方,但是实际过程中的增量应该是(1+e)的 Ct 次方,e 是扩增效率也称扩增系数...
• 实验结果显示 ——扩增曲线;标准曲线;融解曲线(探针法不需要)。 我们以染料法为例,给大家展示在绝对定量中的分析流程: 质粒标准品的制备: 首先设计一对引物从基因组DNA上扩增一段含有目的基因的片段,一般来说这个片段最好是比qPCR扩增的目的片段长100bp左右,然后将扩增的片段连接到载体上构建质粒载体,再转到...
qPCR实验结果分析的几个注意事项 一、Ct值大于等于36的结果是不太行的,因为在35个循环以后,Ct值的变化会比较大,数据会变得不可信。如果有这样的数据,建议重新实验,检查一下是不是模板稀释浓度不对,或者反应体系需要优化,例如引物是否需要重新设计。 二、技术重复的复孔,Ct值的差别应该不大于0.5Ct;因为技术重复的各...
原因分析:如果引物跨内含子,但内含子很短,且gDNA没有去除干净,此时gDNA和cDNA的信号都会被检测到,形成双峰。 解决办法:去除gDNA.或采用探针法; 8.2 引物特异性不好 有非特异性扩增;重新设计引物或使用探针法。 8.3 有引物二聚体:重新设计引物。 强烈建议:进行一次qPCR实验都会让我们多多少少付出一定的心血,所以...