RT-PCR(逆转录PCR) 一、仪器 1.PCR仪 2.恒温水浴 3.小型低温高速离心机 4.紫外分光光度计 5.塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管) ...
反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR),是指以mRNA为模板在反转录酶作用下合成的cDNA 第一链的PCR。该反应分为两步,第一步在单引物的介导和反转录酶的催化下合成RNA 的互补链cDNA; 第二步加热后cDNA 与RNA 链解离,然后与另一引物退火,并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链DNA, 最后同常规PCR一样,...
(3) PCR 扩增:以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和两步法 RT-qPCR 两种)。 (4) 产物分析:通过琼脂糖凝胶电泳(RT-PCR)或荧光信号(RT-qPCR)分析扩增效果。 此外,一种将 RT-PCR 与 qPCR 相结合的技术,逆转录定量实时 PCR(Reverse transcription quantitative real-...
Evaluation of a simple membrane-based nucleic acid preparation protocol for RT-PCR detection of potato viruses from aphid and plant tissues. J. Virol. Methods 121, 163-170.SINGH R P ET AL: " Evaluation of a simple membrane-based nucleic acid preparation protocol for RT-PCR detection of ...
RT-PCR protocolRT-PCR步骤 RNA提取(-70℃保存) 1.六孔板每孔细胞加入1ml Trizol,冰上放置5min,枪头吹打 2.将裂解液1ml转入一新EP管中(1.5ml),加氯仿0.2ml,剧烈振荡混合,室温放置5min,10000 rpm 4℃离心15min 3.转移上层水相(吸70%)到一新EP管中,加入等体积的异丙醇(约0.5ml),振荡混合,室温保存10...
也可直接使用RT-PCR Kit。 (2) 逆转录:设置逆转录程序。 (3) PCR 扩增:以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和两步法 RT-qPCR 两种)。 (4) 产物分析:通过琼脂糖凝胶电泳(RT-PCR)或荧光信号(RT-qPCR)分析扩增效果。
两步法RT-PCR (第一步:逆转录反应) 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μl(11.5μl) Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl (稀释10倍后用) ↓ 混匀,离心,70℃ 5min ↓ 立即冰水浴,稍离心 ↓ 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1× ...
其实Realtime-PCR和qPCR(Quantitative Rea-lti me-PCR)是一码事,都是实时定量PCR,指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录,因此可以对起始模板数量进行精确的分析。 虽然Real-time PCR(实时荧光定量PCR)和Reverse transcription PCR(反转录PCR)看起来都可以缩写为RT-PCR.但是,国际上的约定俗成的是:RT-PCR特指...
This protocol describes the detailed experimental procedure for real-time RT-PCR using SYBR Green I as mentioned in Xiaowei Wang and Brian Seed (2003) A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Research 31(24): e154; pp.1-8. Please refer to this paper and ...
We will provide both one-step and two-step protocols for RT-PCR. We recommend the two-step protocol for this class. In the one-step protocol, the components of RT and PCR are mixed in a single tube at the same time. The one-step protocol generally works well for amplifying targets tha...