比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化RNA用来作为Input样品qPCR得到Ct值B1,则%(IP/Input)=2(B1-A1)*(3/15)*100。IgG/Input的计算也是同理。
4、MeRIP-qPCR结果的计算 MeRIP-qPCR结果计算公式如下表: *其中DF和IF是稀释倍数。如最初用于IP和Input的RNA的比例为a:b,则在计算%(IP/Input)值时,需要乘以稀释倍数b/a(经过IP实验得到的RNA量一定少于不做IP实验的Input的RNA量,且逆转录+qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同,因此要在计算的时候将差异倍数...
有人想:Input样品又没经过IP,qPCR操作不就与普通qPCR没什么差别,那么做了MeRIP-qPCR,不能得到基因表达量的结果吗?比如前面MeRIP-qPCR例子中A和B样品Input分别是1和1.5的结果可以用来看一下这个基因在两样品中的表达量有没有差异?——我们不知道,因为没有***DH等内参基因来计算,要看表达量的话就不知道1和1.5...
MeRIP-qPCR 是 m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我 们就能发现,m6A-IP–qPCR 基本和常规的 RIP–qPCR 相似。当然在 讨论 RIP–qPCR 之前,我们先来看看常规的 RT-qPCR 是如何计算相对 表达量的。 关于RT-qPCR 的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细 讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,...
我们先进行一个简单的计算,常规的RT-qPCR1个反应(1个复孔)需要的totalRNA至少0.1-1μg左右。我们按照最小反应起始量来算的话,那么1个反应需要至少100ng的totalRNA,3个技术重复(3个复孔),总计totalRNA为300ng。 我们知道totalRNA中绝大部分为rRNA,那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟...
MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP–qPCR基本和常规的RIP–qPCR相似。当然在讨论RIP–qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。 关于RT-qPCR的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,所以暂且我们先来看看...
MeRIP-qPCR不需要使用内参来进行样本间的对比,此实验主要是通过计算发生修饰的转录本(IP)占该基因总转录本(Input)的比例,来体现该位点的修饰水平。 4)IP/Input/IgG都需要展示? MeRIP-qPCR的结果用柱状图展示更为直观,文章中常用的有以下3种: 只有IP和Input的数据:展示%(IP/Input)值(图7)。
我们先进行一个简单的计算,常规的 RT-qPCR 1 个反应(1 个复 孔)需要的 total RNA 至少 0.1-1ug 左右。我们按照最小反应起始量 来算的话,那么 1 个反应需要至少 100ng 的 total RNA,3 个技术重 复(3 个复孔),总计 total RNA 为 300ng。 我们知道 total RNA 中绝大部分为 rRNA,那么只有不到 5%的...
MeRIP-qPCR结果计算如下表: *其中DF和IF分别是稀释倍数。是说一个样品,由于其中IP到的RNA量一定会比不IP直接保留的Input的RNA量少很多,IP和Input实际取来做逆转录+qPCR的模板稀释倍数不同,因此要把这个倍数考虑进去。比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化...
MeRIP-qPCR结果计算如下表: *其中DF和IF分别是稀释倍数。是说一个样品,由于其中IP到的RNA量一定会比不IP直接保留的Input的RNA量少很多,IP和Input实际取来做逆转录+qPCR的模板稀释倍数不同,因此要把这个倍数考虑进去。比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化...