MeRIP-qPCR结果计算公式如下表: *其中DF和IF是稀释倍数。如最初用于IP和Input的RNA的比例为a:b,则在计算%(IP/Input)值时,需要乘以稀释倍数b/a(经过IP实验得到的RNA量一定少于不做IP实验的Input的RNA量,且逆转录+qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同,因此要在计算的时候将差异倍数考虑进去)。一般用于逆转录...
当然这⼀步需要进⾏线性归⼀化处理，⽅法与上⾯的RT-qPCR 类似，其公式为：%input = 2（-ΔCt normalized RIP）由于⽆法判断m6A抗体是否存在⾮特异性富集的情况，所以要过滤这些噪⾳还需要使⽤兔抗IgG 再对RNA进⾏⼀次富集。这时候就需要对ΔCt再次进⾏背景去除。其中需要检测的⽬的基因...
MeRIP-qPCR 是 m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我 们就能发现,m6A-IP–qPCR 基本和常规的 RIP–qPCR 相似。当然在 讨论 RIP–qPCR 之前,我们先来看看常规的 RT-qPCR 是如何计算相对 表达量的。 关于RT-qPCR 的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细 讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,...
文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度> 2nM),以保证文库质量。 (四)上机测序 文库检测合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina...
⽂库构建完成后,先使⽤Qubit2.0进⾏初步定量,稀释⽂库⾄1ng/ul,随后使⽤Agilent 2100对⽂库的insert size进⾏检测,insert size符合预期后,使⽤qPCR⽅法对⽂库的有效浓度进⾏准确定量(⽂库有效浓度> 2nM),以保证⽂库质量。 (三)上机测序 ...
换句话说就是有input中的某个基因究竟有百分之多少发生了甲基化,所以这里我们用%input来表示。基本上到这一步,部分老师不想做IgG验证的,会把这个数据直接放在论文里,但是我们建议还是要加入IgG的部分。当然这一步需要进行线性归一化处理,方法与上面的RT-qPCR类似,其公式为:...
接下来我们就要详细讨论下m6A-IP-qPCR是如何计算相对表达量的。 MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP–qPCR基本和常规的RIP–qPCR相似。当然在讨论RIP–qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。
接下来我们就要详细讨论下m6A-IP-qPCR是如何计算相对表达量的。 MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP–qPCR基本和常规的RIP–qPCR相似。当然在讨论RIP–qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。
文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度> 2nM),以保证文库质量。 (四)上机测序 文库检测合格后,...
ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组 相对表达量=2(-ΔΔCt) 也就是处理组中某基因的表达量是对照组中表达量的2-ΔΔCt倍。我们假设ΔCt处理组和ΔCt对照组分别是7和10,那么ΔΔCt=-3,最后相对表达量为8(2的3次方)。 meRIP-qPCR知识解读(2)