MeRIP-qPCR结果计算公式如下表: *其中DF和IF是稀释倍数。如最初用于IP和Input的RNA的比例为a:b,则在计算%(IP/Input)值时,需要乘以稀释倍数b/a(经过IP实验得到的RNA量一定少于不做IP实验的Input的RNA量,且逆转录+qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同,因此要在计算的时候将差异倍数考虑进去)。一般用于逆转录...
MeRIP-qPCR 是 m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我 们就能发现,m6A-IP–qPCR 基本和常规的 RIP–qPCR 相似。当然在 讨论 RIP–qPCR 之前,我们先来看看常规的 RT-qPCR 是如何计算相对 表达量的。 关于RT-qPCR 的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细 讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,...
那么我们⾸先依旧是与传统的RT-qPCR相似，⽤相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰，以保证引物特异性扩增。然后就是校准每⼀个样本的平均Ct值，以消除样本准备过程中的差异。接下来我们就要开始对每个样本中，RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值，再对3个⽣物学重复样本中的Ct平均值再去...
文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度> 2nM),以保证文库质量。 (四)上机测序 文库检测合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina...
⽂库构建完成后,先使⽤Qubit2.0进⾏初步定量,稀释⽂库⾄1ng/ul,随后使⽤Agilent 2100对⽂库的insert size进⾏检测,insert size符合预期后,使⽤qPCR⽅法对⽂库的有效浓度进⾏准确定量(⽂库有效浓度> 2nM),以保证⽂库质量。 (三)上机测序 ...
利用超几何分布检验计算go功能显著富集的p值,再对p值进行benjamini&hochberg多重检验纠正,fdr≤0.05的goterms被认为显著富集。使用kegg数据库对差异peak关联基因进行pathway的功能注释和归类,keggpathway功能富集方法同go分析。 (5)根据所鉴定的结果,选择10个基因使用merip-qpcr方法对merip-seq富集和测序结果进行验证 在...
我们先进行一个简单的计算,常规的RT-qPCR1个反应(1个复孔)需要的totalRNA至少0.1-1μg左右。我们按照最小反应起始量来算的话,那么1个反应需要至少100ng的totalRNA,3个技术重复(3个复孔),总计totalRNA为300ng。 我们知道totalRNA中绝大部分为rRNA,那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟...
√同样推荐每次MeRIP样本qPCR反应做三个复孔演示. √如果使用相对标准曲线方法,从输入样本中取10%的RNA连续稀释5-或10-倍 演示4个点,并采用这 些样本来建立标准曲线.使用标准曲线,作为输入的MeRIP样本的浓度可以计算得出百分比.此外,涉及到 的等量细胞或纯化的RNA质量可以计算得出数据. 2.按照如下表3制备主要的...
MeRIP-qPCR结果计算如下表: *其中DF和IF分别是稀释倍数。是说一个样品,由于其中IP到的RNA量一定会比不IP直接保留的Input的RNA量少很多,IP和Input实际取来做逆转录+qPCR的模板稀释倍数不同,因此要把这个倍数考虑进去。比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化...
MeRIP-qPCR结果计算如下表: *其中DF和IF分别是稀释倍数。是说一个样品,由于其中IP到的RNA量一定会比不IP直接保留的Input的RNA量少很多,IP和Input实际取来做逆转录+qPCR的模板稀释倍数不同,因此要把这个倍数考虑进去。比如15μg的片段化RNA经过IP后的RNA全部拿去做IP样品的qPCR实验得到Ct值A1, 另3μg的片段化...