最后计算稀释系数,即input dilution factor,也就是input的RNA占m6A-IP的RNA有多少比例。根据上面的示例,也就是input RNA=100ng而m6A-IP RNA=1ug,那此处的稀释系数=10%。最后根据这些数值,我们可以计算出归一化后的ΔCt值,也叫ΔCt normalized RIP。 这里为什么归一化后的ΔCt normalized RIP还要减去log2(input ...
根据RNA-seq分析YTHDF2在许多类型的细胞或组织中负责调节mRNA的翻译、衰变和清除。然后,还可以用RNA免疫沉淀(RIP)qPCR方法检测了YTHDF2的候选靶向mRNA及其在处理后的变化。 图6 处理组通过YTHDF2识别和衰退减少肺细胞中抗铁死亡相关基因的表达 这样就进一步增加了机制的研究文章的档次也就上去了。 先有鸡再有蛋 第...
未显示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因,因为它们与PELI2没有通路连接。qRT-PCR检测ALKBH5敲低后16个候选基因的表达。实验重复3次,mRNA的相对表达量以平均值±SD表示。单因素方差分析,*P<0.05;** p<0.01。IGV轨迹显示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆盖。m6A-RIP-qPCR检测证实PELI2...
未显示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因,因为它们与PELI2没有通路连接。 qRT-PCR检测ALKBH5敲低后16个候选基因的表达。实验重复3次,mRNA的相对表达量以平均值±SD表示。单因素方差分析,*P<0.05;** p<0.01。 IGV轨迹显示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆盖。 m6A-RIP-qPCR检测证实...
(c) qRT-PCR检测绒毡层发育和花粉外壁积累所需的基因。 (5)OsALKBH9基因功能丧失导致水稻转录组范围内m6A修饰高甲基化 图5:OsALKBH9基因功能丧失导致转录组范围的m6A高甲基化。 火山图结果显示了Osalkbh9-1与野生型(WT)之间m6A修饰变化。累积分数图和箱线图显示Osalkbh9-1和WT中m6A峰值的log2(富集倍数)。
MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。 关于RT-qPCR的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,所以暂且我们先来看看相对...
通过RIP-PCR，可发现IL-11和SERPINE 2为受YTHDF2调控的靶基因（图5B）。放线菌素D刺激下，YTHDF2缺失细胞的IL-11和SERPINE2 mRNA 衰减明显延长，而YTHDF2过表达细胞的IL-11和SERPIN E2衰减明显缩短（图5C、D）。分析患者肝癌组织可发现在IL-11和SERPIN E2的3＇UTR区有高丰度的m6A修饰（图5E）。荧光素酶...
利用RIP-PCR,我们发现FAT4 mRNA在正常黑素细胞和mettl14过表达的眼部黑素瘤细胞中都特异性地与YTHDF1结合,而在其他reader蛋白(YTHDF2和3)与FAT4 mRNA之间观察到微弱的相互作用信号(图6C)。因此,沉默YTHDF1显著抑制了FAT4的表达,而在ythdf2 /3沉默的细胞中FAT4的表达保持不变(图6D)。有趣的是,外源性METTL...
建立细胞模型和异种原位移植 (Orthotopic Xenograft) 肿瘤模型以鉴定METTL14和FAT4在眼部黑色素瘤生长中的作用。采用RIP-qPCR、MeRIP-seq、miCLIP-seq和RNA稳定性实验来研究FAT4对m6A水平的作用机制。 研究结果首先表明了眼部黑色素瘤细胞对HDACis的易感性。HDACis触发眼黑色素瘤中m6A RNA修饰的升高。进一步的研究表明...
使用人AEG细胞系进行细胞培养,并进行质粒转染。qRT-PCR、免疫印迹等方法分析基因和蛋白表达。细胞增殖、迁移、集落形成实验、荧光素酶报告基因检测等功能性实验。RNA-seq、RIP/meRIP-seq、LACE-seq等测序分析。裸鼠模型的体内实验评估IGF2BP3 KD或CDC25A过表达对肿瘤形成和生长的影响。