转录抑制（CRISPRi）：通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对，dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点（TSS）附近，通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸，还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始，达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas...
提高转录抑制或激活的sgRNA优化细节:对于CRISPRi,靶向特定基因TSS的-50至+300bp区间可实现强抑制,在TSS下游+50bp至+100bp处可实现最大抑制效果;sgRNA中避免出现连续相同碱基序列(例如TTTT或CCCC)。对于使用多激活因子串联的CRISPRa,当靶向TSS上游-50bp至-400bp的区间时,发现了最佳的基因激活;对于使用SAM系统的激活,...
转录抑制(CRISPRi):通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对,dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点(TSS)附近,通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸,还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始,达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率,dCas9可融合...
作者还将dCas9–SSAP与作者以前的SSAP增强的野生型Cas9工具进行了比较,发现与引入DNA切割时相比,基于dCas9的编辑器具有强大但降低的活性,此外,作者的数据显示,单sgRNA dCas9-SSAP编辑器足以进行有效的敲入,当使用两个gRNA时有微小的提高。 图14 Comparison of the knock-in efficiencies of dCas9–SSAP and other ...
CRISPRa的优势:与CRISPRi一致,CRISPRa可以激活内源基因组的转录,但不会改变靶基因位点基因组序列;无需预先了解靶标基因的天然调控机理,仅需知晓靶位点DNA序列的准确信息;使用SAM系统进行转录激活的基因通常可以得到较高水平的表达,但该系统需要三个载体共同作用,转染/感染难度相对较大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特...
为了增强激活能力,科学家们在dCas9-VP64的基础结构上开发了第二代dCas9-SAM(synergistic activation mediator,SAM)系统(图3),其中sgRNA经过修饰,可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这种修饰的sgRNA包含了两段可结合噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构。MS2蛋白可以与另外的转录激活因子融合,这使得该系统具...
作者还将dCas9–SSAP与作者以前的SSAP增强的野生型Cas9工具进行了比较,发现与引入DNA切割时相比,基于dCas9的编辑器具有强大但降低的活性,此外,作者的数据显示,单sgRNA dCas9-SSAP编辑器足以进行有效的敲入,当使用两个gRNA时有微小的提高。 图14 Comparison of the knock-in efficiencies of dCas9–SSAP and other ...
sgRNA 质粒的构建方法 1）用 BbsI 在 37℃条件下酶切载体质粒 pAC1371。2）琼脂糖凝胶电泳，切胶用 ...
1.设计sgRNA 2.构建sgRNA表达载体 3.构建dCas9-p300组蛋白乙酰化系统,dCas9-LSD1组蛋白去甲基化系统,dCas9-Tet1-CD DNA去甲基化系统,dCas9-DNMT3A DNA甲基化系统 4.建立dCas9-SAM稳转株、dCas9-KRAB稳转株 5 .转染sgRNA 6 .ChIP检测dCas9系统的靶向效率 ...
CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子(如VP64、VPR、SAM或SunTag)或转录抑制因子(如KRAB)融合后,结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。 CRISPR-dCas9系统是通过激活或抑制细胞内源基因表达来提高或抑制目标基因的表达量,它不需要转入外源DNA,操作更简易。此系统可在同一个启动子上设计多个sgRNA来提高或抑制基因...