转录抑制（CRISPRi）：通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对，dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点（TSS）附近，通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸，还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始，达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas...
提高转录抑制或激活的sgRNA优化细节:对于CRISPRi,靶向特定基因TSS的-50至+300bp区间可实现强抑制,在TSS下游+50bp至+100bp处可实现最大抑制效果;sgRNA中避免出现连续相同碱基序列(例如TTTT或CCCC)。对于使用多激活因子串联的CRISPRa,当靶向TSS上游-50bp至-400bp的区间时,发现了最佳的基因激活;对于使用SAM系统的激活,...
转录抑制(CRISPRi):通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对,dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点(TSS)附近,通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸,还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始,达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率,dCas9可融合...
提高转录抑制或激活的sgRNA优化细节:对于CRISPRi,靶向特定基因TSS的-50至+300bp区间可实现强抑制,在TSS下游+50bp至+100bp处可实现最大抑制效果;sgRNA中避免出现连续相同碱基序列(例如TTTT或CCCC)。对于使用多激活因子串联的CRISPRa,当靶向TSS上游-50bp至-400bp的区间时,发现了最佳的基因激活;对于使用SAM系统的激活,...
CRISPR-dCas9系统是通过激活或抑制细胞内源基因表达来提高或抑制目标基因的表达量,它不需要转入外源DNA,操作更简易。此系统可在同一个启动子上设计多个sgRNA来提高或抑制基因的转录活性,目的基因的转录本也会覆盖的更全面。图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因转录激活与抑制(Gilbert LA, et al., Cell, 2013) ...
CRISPRa的优势:与CRISPRi一致,CRISPRa可以激活内源基因组的转录,但不会改变靶基因位点基因组序列;无需预先了解靶标基因的天然调控机理,仅需知晓靶位点DNA序列的准确信息;使用SAM系统进行转录激活的基因通常可以得到较高水平的表达,但该系统需要三个载体共同作用,转染/感染难度相对较大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特...
通过分析Cas9与靶向DNA之间的结合机制,研究团队发现,优化sgRNA的序列能够显著提高编辑的特异性,减少脱靶效应。因此,他们对sgRNA的序列进行了系统的优化,筛选出多种在特定靶点上具有极高特异性的sgRNA组合。在实验中,这些优化后的sgRNA与iGeo...
构建sgRNA质粒的方法包括：使用BbsI酶在37℃条件下对载体质粒pAC1371进行酶切；通过琼脂糖凝胶电泳切胶，使用DNA片段回收试剂盒回收目的载体片段；进行引物退火，使用特定参数在PCR环仪中进行；使用连接酶进行连接；进行质粒转化，包括将连接产物加入到感受态细胞中，于冰盒中静置孵育25-30分钟，将细胞置于42℃...
1.设计sgRNA 按照“20N+NGG(PAM)”的设计原理设计sgRNA,至少设计3条。 2.构建sgRNA和dCas9-target 质粒 3.构建dCas9-target稳转株 稳转株蛋白构建完成后,用flag抗体或目的蛋白抗体检测稳转株是否构建成功,如果载体上有荧光蛋白,可用荧光检测细胞株是否构建成功。 图3 荧光检测图片 A转染筛选后明场图片 B转染筛选后...
(b)在一个载体中共表达四种sgRNA(sgTS1、sgTS2、sgTS3和sgTS4)。(c)mCherry-CRISPR-Tag_v1被插入到人类H2B基因的C端,以黄色突出显示。(d)H2B-mCherry和H2B基因座在细胞周期不同阶段的可视化图像。(e)H2B基因座标记效率的量化。(f)利用CRISPR-Tag系统同时显示mCherry-LMNA和LMNA基因座的代表性图像。(g)LMNA...