转录抑制（CRISPRi）：通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对，dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点（TSS）附近，通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸，还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始，达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas...
转录抑制(CRISPRi):通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对,dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点(TSS)附近,通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸,还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始,达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率,dCas9可融合...
转录抑制(CRISPRi):通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对,dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点(TSS)附近,通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸,还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始,达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率,dCas9可融合...
实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基本原理是,Cas9 蛋白与人工设计的 sgRNA 结合成为 sgRNA-Cas9 蛋白复合体并在其引导之下结合到特定的核苷酸序列切割目标 DNA分子造成双链断裂,细胞内非同源末端连接的方式(NHEJ)造成断裂位点随机插入、删除等突变。CRISPR/Cas9 系统通过这种方式引入特定位...
再将多个代谢途径酶与SpyTag短肽相融合,从而形成(酶-SpyTag):(SpyCatcher-dCas9)复合体,该复合体在不同sgRNA的引导下,能够以模块化的方式将每种酶引导到DNA模板上的特定位置。 研究人员首先利用荧光蛋白验证了目标蛋白在DNA支架上纳米范围内的可编程定位,随后将紫色杆菌素生物合成途径的五种酶以不同的方式组装在一...
CRISPR-dCas9系统是通过激活或抑制细胞内源基因表达来提高或抑制目标基因的表达量,它不需要转入外源DNA,操作更简易。此系统可在同一个启动子上设计多个sgRNA来提高或抑制基因的转录活性,目的基因的转录本也会覆盖的更全面。图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因转录激活与抑制(Gilbert LA, et al., Cell, 2013) ...
图3 CRISPR/dCas9介导的基因激活系统的改良策略。dCas9可以与转录激活因子,如VP64、EDLL、TAL和其他TAD融合。sgRNA经过修饰也可以与转录激活因子结合(Mahdi et al., 2019)。 除了上述两种激活系统外,Lowder等人还开发了一个多重转录激活剂样效应器激活系统mTALE-Act,用于植物中多重转录激活。该系统允许多达四个TAL...
此外,因为SpCas9-sgRNA高特异性变体(比如eSpCas9,SpCas9-HF1和截短sgRNA)可以提高基因编辑的安全性,但通常以效率降低为代价,团队因此测试了基于dSaCas9的临近结合对这些SpCas9-sgRNA变体诱导的HDR效率的影响,发现dSaCas9的临近结合也同样可以提升SpCas9-sgRNA变体诱导的HDR效率,并利用该策略改进了SpCas9-sgRNA高特异性...
Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA链条，并把其称为sgRNA(single-...
为了增强激活能力,科学家们在dCas9-VP64的基础结构上开发了第二代dCas9-SAM(synergistic activation mediator,SAM)系统(图3),其中sgRNA经过修饰,可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这种修饰的sgRNA包含了两段可结合噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构。MS2蛋白可以与另外的转录激活因子融合,这使得该系统具...