CUT&Tag与ATAC-seq联手,解析表观遗传机制 CUT&Tag:CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作新兴的实验方法,该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶精确切割目标蛋白结合的DNA区域,并在这些序列的两端加上测序接头,经过PCR扩增后形成可用于高通量测序的文库,随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。CUT&Tag...
CUT&Tag 原理 CUT&Tag是蛋白-DNA互作的一大革新技术,它不需要使用甲醛交联以及免疫共沉淀,而是通过针对靶蛋白(如转录因子、染色质重塑蛋白)的抗体和Protein A的介导,使得与Protein A融合的Tn5酶(Tagmentase)在切割DNA片段的同时在序列两端加上测序接头,经PCR扩增后形成可以直接用于高通量测序的文库(具体参考图1)。使...
同时CUT&Tag可以对极少量细胞(60个细胞)进行操作,实现单细胞测序。Protein A-Tn5在细胞内进行核酸切割,PCR之前的反应都在细胞内进行。Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序。 图5. 单细胞CUT&Tag测序流程(Henikoff,2019) Part III 翌圣CUT&Tag产品重磅上线...
细胞量低至1000个细胞以下时,其送样与常规细胞量项目有区别,原则在于避免样本损失,我们建议:将细胞悬在10μL PBS中即可(使用低吸附的PCR管),液氮速冻干冰运输。 试剂盒产品: 我们公司同时提供CUT&Tag assay kit试剂盒,pATn5酶等产品,详情请点击下方链接了解。
通过使用Binding buffer活化磁珠,来提高磁珠结合细胞核的能力。如果有多个CUT&Tag样本处理,为了确保反应的一致性和准确性,建议首先在单个1.5-2 mL离心管中批量处理所有反应需要的ConA磁珠,之后再将磁珠分装到8连排的PCR管中,这样可以确保每个样本中磁珠的数量和活性保持一致,从而提高实验结果的可比性和可靠性。
图2 CUT&Tag与ChIP的实验流程 (Tao et al., 2020)。作者比较了CUT&Tag与ChIP的实验流程,发现CUT&Tag实验操作过程中不需要进行实验材料的交联和DNA超声处理,通过Tn5将结合蛋白的染色质片段破碎后,片段就已经与接头整合,可以直接进行PCR富集和NGS,总之CUT&Tag在操作简便性和所需的实验时间方面优于ChIP。
与经典ChIP-seq不同,CUT&Tag细胞未用甲醛固定,也不需要进行超声处理,下面就详细介绍了CUT&Tag的实验流程,包括细胞与磁珠结合、结合一抗、pA-Tn5衔接子转座体、标签化、DNA提取、PCR、高通量测序。 试剂 洋地黄皂苷 (5%):将50 mg洋地黄皂苷溶解在1 ml DMSO中。
靶蛋白特异性抗体(一抗)进入细胞与靶蛋白结合,二抗孵育放大信号,pA/G-Tn5融合蛋白与一抗和二抗结合,把转座体间接的固定在靶蛋白上。Mg2+激活Tn5酶,切割靶标区域。由于Tn5连有测序接头,在打断的同时直接在片段化的DNA两端添加接头,最终通过PCR扩增获得完整的文库。
CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法。该技术使用磁珠吸附活细胞,洋地黄皂苷打开细胞膜的通透性;pA-Tn5转座酶在抗体引导下精确结合靶蛋白附近的DNA序列,由于Tn5连有测序接头,可以直接在片段化的 DNA 两端添加接头,最终通过PCR扩增获得完整的文库。
1.5mL 管 600g 5min, washing buffer 洗两次 600g 5min。 一抗孵育 二抗孵育1:100稀释 置于磁力架上,2min, 弃上清 pA/G-Tnp转座了孵育 1:500稀释,混合 均匀,1h dna片段化,37度孵育60min DNA提取, 。。。开盖凉干,但磁珠不反光,20卫生 PCR。