CRISPRi技术依靠生成一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白。这是通过往RuvC和NHN两个核酸酶结构域分别导入氨基酸突变D10A和H840A,使得Cas9蛋白失去切割DNA活性,但仍保留结合DNA的能力,这样的Cas9 称之为dCas9(Dead Cas9)。 图5. dCas9结构域 当dCas9被引导到某个基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCa...
直接将dCas9与单个转录激活因子(如VP64或VP16)融合表达,对靶基因的调控能力较弱。为了提高表达水平,可将多个转录激活因子同时融合于dCas9,如三元转录激活因子VPR(VP64-p65-Rta)融合到dCas9的C端,产生融合蛋白dCas9-VP64-p65-Rta(dCas9-VPR)。此外,还可以通过分子挂钩来招募转录激活因子到dCas9周围,如:将SunTag...
CRISPRi (基因抑制/沉默)系统是用于抑制内源性基因转录的强大工具,当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过,导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB,可以进一步提高转录抑制...
CRISPRi使用催化失活的Cas9(dCas9),dCas9能到达引导RNA指定的位点,但无力对DNA进行剪切(Cell, 152:1173-83, 2013)。当dCas9结合到基因组的时候,会阻断转录机器的结合,阻止这一过程的进行。 改良版CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子(KRAB)的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展,使其难以得到转录。
专利摘要显示，本发明公开了一种CRISPRi基因抑制系统在基因工程菌构建中的应用。所述CRISPRi基因抑制系统包含：dCas9表达盒和sgRNA表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的启动子，所述sgRNA表达盒包括编码所述sgRNA的核苷酸序列及其上游的启动子，具体如正文所述。本发明的CRISPRi基因抑制系统在不破坏px...
近日,吉林大学李占军教授团队在Science Advances发表了题为Precise large-fragment deletions in mammalian cells and mice generated by dCas9-controlled CRISPR/Cas3的研究成果。该研究证明了dCas9可用于精确调控Type I-E介导的DNA片段缺...
CRISPRa技术则利用dCas9融合转录激活因子，通过gRNA引导dCas9到目标基因的启动子或增强子区域，激活基因转录。融合蛋白如VP64、p65或RTA等，通过吸引转录机器，增加目标基因的转录水平，实现基因激活。为了提高激活效率，可将多个激活因子融合于dCas9，或通过分子挂钩招募转录激活因子到dCas9周围。CRISPRa/i技术...
dCas9与转录抑制子连接,如KRAB(Kruppel associated box),dCas9-KRAB融合蛋白在gRNA指引下,结合到靶基因TSS位点,抑制转录起始,沉默靶基因的表达。 图3. CRISPRi系统示意图。图片来自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416. CRISPRi 研究案例 dCas9融合KRAB的CRISPRi系统(dCas9-KRAB)在海马神经元中能...
随着CRISPR技术的快速发展,CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)已成为研究非编码区域功能的有力工具。CRISPRi利用dCas9蛋白质和引导RNA(sgRNA)的系统,通过靶向特定的DNA序列来抑制附近基因的表达,而不改变DNA序列。这种方法的优势在于其...
同理,dCas9融合体也可用来激活基因表达,这被称为CRISPRa(CRISPR激活)。与转录激活因子(如VP64和p65)融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域,导致基因表达上调。为了增强“战斗力”,dCas9融合体需要招募多个激活结构域。目前人们已经开发出几种系统,包括多重融合体(VPR,即VP64、p65和Rta5的三重融合体)、使用蛋白质...