为了进一步提高转录抑制的效率,dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB(krüppel-associated box)结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB。此外,dCas9也可以融合双抑制结构域(bipartite repressor domain)KRAB-MeCP2,抑制效果更佳。 图6. dCas9-KRAB CRISPRi工作原理 一个完整的dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统包含两...
CRISPRi是基于CRISPR-Cas9系统的一种基因抑制技术[1],利用一种“催化失活”的Cas9蛋白(dCas9)来实现基因抑制。dCas9蛋白在目标DNA上结合并定位到特定的基因区域,但不再进行剪切。通过将转录抑制因子(如KRAB域)与dCas9融合,可以有效地抑制目标基因的转录,从而降低基因的表达水平。CRISPRi的关键特征是通过这种方式“关...
CRISPRi (基因抑制/沉默)系统是用于抑制内源性基因转录的强大工具,当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过,导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB,可以进一步提高转录抑制...
CRISPRi使用催化失活的Cas9(dCas9),dCas9能到达引导RNA指定的位点,但无力对DNA进行剪切(Cell, 152:1173-83, 2013)。当dCas9结合到基因组的时候,会阻断转录机器的结合,阻止这一过程的进行。 改良版CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子(KRAB)的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展,使其难以得到转录。
一、CRISPRi筛选可以识别影响侵袭的lncRNA 研究人员使用了CRISPRi进行基因敲除，以筛选和鉴定影响体外胶质瘤细胞侵袭的lncRNA。他们通过将U87特异性 CRISPRi 文库包装到慢病毒中，并转导到稳定表达 dCas9-KRAB 的 U87 细胞中，从中筛选获得1000 倍覆盖率的sgRNA。使用嘌呤霉素筛选感染细胞，并将其接种到 Matrigel ...
CRISPR应用广泛,其中一种叫做CRISPRi的方法利用了无酶活性的Cas9 (dCas9)融合KRAB转录抑制结构域,CRISPRi不切割靶基因,而是在dCas9靶向转录起始位点(TSS)时降低靶基因的表达。利用测序来读取sgRNA的相对富集/或耗竭,这一技术也被应用于全基因组范围内调查基因功能。
图1. dCas9结构域 当dCas9被引导到某个基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB（krüppel-associated box）结构域，此外，dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2，抑制效果更...
CRISPRi也称为CRISPR干扰 (CRISPR interference or inhibition) 。dCas9与转录抑制子连接,如KRAB(Kruppel associated box),dCas9-KRAB融合蛋白在gRNA指引下,结合到靶基因TSS位点,抑制转录起始,沉默靶基因的表达。 图3. CRISPRi系统示意图。图片来自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416. ...
在CRISPRi技术中，dCas9与gRNA结合后定位到目标基因的启动子区域，通过阻止RNA聚合酶的结合或延伸，显著抑制基因转录活动，实现基因沉默。为了增强转录抑制效果，dCas9可融合KRAB或双抑制结构域，结合到靶基因TSS位点，抑制转录起始。CRISPRa技术则利用dCas9融合转录激活因子，通过gRNA引导dCas9到目标基因的启动...
GeneHero™预制稳转株是稳定表达dCas9-KRAB融合蛋白的哺乳动物细胞系,用于研究内源性基因的转录抑制。这些CRISPRi细胞株已稳定整合人密码子优化的dCas9,并与转录抑制肽KRAB融合,以沉默靶基因的表达。 GeneHero™ CRISPRi预制稳转株为dCas9-KRAB稳定表达的单克隆细胞株。使用时只需简单地将启动子靶向的sgRNA或CRISPR...