随着dCas9 发现和应用的成熟,CRISPR-dCas9 系统应运而生,逐渐成为科学家分子生物学用于激活和抑制基因表达研究的新工具。 sgRNA 的设计 sgRNA,单链引导 RNA,作为 CRISPR/Cas9 系统中 cas 蛋白的引导序列,可参照 sgRNA 工具网站(http://crispr.mit.edu)设计多条 sgRNA 以降低脱靶率。 sgRNA 质粒的构建方法 1)...
将这两个保守的核酸内切酶结构域进行突变,其中RuvC催化结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)以及HNH催化结构域的第840位组氨酸突变为丙氨酸(H840A),Cas9蛋白将失去核酸内切酶活性,失去活性的Cas9称之为dead Cas9(dCas9)(Qi et al., 2013)。
按照CRISPR-dCas9 靶向基因组编辑系统的作用原理和调控方式,可将其分为以下几种: (1) dCas9- 转录调控蛋白融合系统; 基于sgRNA 引导dCas9 识别并结合目的基因DNA 的原理,研究人员将不同的转录激活结构域直接与dCas9 蛋白融合,利用dCas9的DNA 结合活性,直接( 或间接) 将各类转录激活因子携带到目的基因的转录起始...
细胞内的非同源末端连接方式(NHEJ)会导致断裂位点随机插入、删除等突变,从而在特定位点引入突变。dCas9 是通过抑制 Cas9 核酸酶的 RuvC 和 HNH 两个结构域的活性得到的。dCas9 系统只有结合基因组序列的能力,却没有在基因组序列上切割的能力。CRISPR/dCas9 系统分别融合一个激活元件或一个抑制元件时,会产生基因激...
然而,这些策略旨在提高基于 dCas9 的转录调控的效率,同时缺乏一个单独的节点来精确控制基于 dCas9 的系统,这限制了 CRISPR-dCas9 系统实现的复杂合成电路的构建。为此,已经引入了化学或光诱导模块来对 CRISPR-dCas9 系统进行外部控制,但是可以...
然而,这些策略旨在提高基于 dCas9 的转录调控的效率,同时缺乏一个单独的节点来精确控制基于 dCas9 的系统,这限制了 CRISPR-dCas9 系统实现的复杂合成电路的构建。为此,已经引入了化学或光诱导模块来对 CRISPR-dCas9 系统进行外部控制,但是可以很容易地编程以感知细胞信号的内部控制方法仍然很少。因此,引入基因模块来实...
CRISPR 酶 Cas9 32101-01 100 pmol 32101-02 500 pmol 32101-03 1,000 pmol dCas9 32102-01 100 pmol 32102-02 500 pmol 32102-03 1,000 pmol NLS-Cas9 32103-01 100 pmol 32103-02 500 pmol 32103-03 1,000 pmol AsCas12a(cpf1) 32104-01 100 pmol 32104-02 500 pmol 32104-03 1,000 pmol ...
然而,这些策略旨在提高基于dCas9的转录调控的效率,同时缺乏一个单独的节点来精确控制基于dCas9的系统,这限制了 CRISPR-dCas9 系统实现的复杂合成电路的构建。为此,已经引入了化学或光诱导模块来对CRISPR-dCas9系统进行外部控制,但是可以很...
(3)dCas9-sgRNA复合物作为一个支架将一系列效应分子募集到特定的位置来激活基因转录或因空间位阻阻止RNA聚合酶与启动子结合及抑制转录延伸,从而发挥调节功能(田开仁等,2018)。 近年来,CRISPR/dCas9系统的应用不断扩大和多样化,相关的文章也如雨后春笋般相继发表出来,接下来就和伯小远一起去看看CRISPR/dCas9系统在基...
CRISPR-dCas9系统简介 dCas9蛋⽩是Cas9蛋⽩的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发⽣突变。因此，dCas9蛋⽩的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进⼊基因组的能⼒。CRISPR-dCas9系统提供了⼀个研究定点转录调控的平台。在这个平台中，dCas9主要是与其他效应蛋⽩融合（如GFP、...