随着dCas9 发现和应用的成熟,CRISPR-dCas9 系统应运而生,逐渐成为科学家分子生物学用于激活和抑制基因表达研究的新工具。 sgRNA 的设计 sgRNA,单链引导 RNA,作为 CRISPR/Cas9 系统中 cas 蛋白的引导序列,可参照 sgRNA 工具网站(http://crispr.mit.edu)设计多条 sgRNA 以降低脱靶率。 sgRNA 质粒的构建方法 1)...
CRISPR-dCas9系统是通过激活或抑制细胞内源基因表达来提高或抑制目标基因的表达量,它不需要转入外源DNA,操作更简易。此系统可在同一个启动子上设计多个sgRNA来提高或抑制基因的转录活性,目的基因的转录本也会覆盖的更全面。图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因转录激活与抑制(Gilbert LA, et al., Cell, 2013) ...
按照CRISPR-dCas9 靶向基因组编辑系统的作用原理和调控方式,可将其分为以下几种: (1) dCas9- 转录调控蛋白融合系统; 基于sgRNA 引导dCas9 识别并结合目的基因DNA 的原理,研究人员将不同的转录激活结构域直接与dCas9 蛋白融合,利用dCas9的DNA 结合活性,直接( 或间接) 将各类转录激活因子携带到目的基因的转录起始...
图1 CRISPR-dCas9的应用总结(Lo et al., 2017)。 1 基因激活与抑制 01CRISPR/dCas9基因激活系统 首先激活特定基因的表达可以通过dCas9与转录调节因子VP64、EDLL等的融合来实现(图2)。将dCas9与典型的转录激活因子VP64融合后,当dCas9-VP64通过gRNA靶向到靶基因的启动子序列时,该复合物通常能够招募调节哺乳动物...
这种名为CAPTURE的方法利用生物素标记的dCas9来分离与天然的染色质背景相互作用的调控元件(CRE和TRE)。CAPTURE包括三个关键的组分:1) 带有生物素接受位点的dCas9;2) 生物素连接酶BirA,它将生物素添加到接受位点;3) 将生物素化的dCas9引到目的位点的gRNA。靶...
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基本原理是,Cas9 蛋白与人工设计的 sgRNA 结合形成 sgRNA-Cas9 蛋白复合体,在 sgRNA 的引导下结合到特定的核苷酸序列,切割目标 DNA 分子,造成双链断裂。细胞内的非同源末端连接方式(NHEJ)会导致断裂位点随机插入、删除等突变,从而在特定位点引入突变。dCas9 是通过抑制 Cas9 核酸酶的 RuvC...
然而,这些策略旨在提高基于 dCas9 的转录调控的效率,同时缺乏一个单独的节点来精确控制基于 dCas9 的系统,这限制了 CRISPR-dCas9 系统实现的复杂合成电路的构建。为此,已经引入了化学或光诱导模块来对 CRISPR-dCas9 系统进行外部控制,但是可以...
CRISPR-dCas9系统简介 dCas9蛋⽩是Cas9蛋⽩的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发⽣突变。因此，dCas9蛋⽩的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进⼊基因组的能⼒。CRISPR-dCas9系统提供了⼀个研究定点转录调控的平台。在这个平台中，dCas9主要是与其他效应蛋⽩融合（如GFP、...
CRISPR 酶 Cas9 32101-01 100 pmol 32101-02 500 pmol 32101-03 1,000 pmol dCas9 32102-01 100 pmol 32102-02 500 pmol 32102-03 1,000 pmol NLS-Cas9 32103-01 100 pmol 32103-02 500 pmol 32103-03 1,000 pmol AsCas12a(cpf1) 32104-01 100 pmol 32104-02 500 pmol 32104-03 1,000 pmol ...
只需简单的基因工程改造,就能利用CRISPR/Cas进行DNA、RNA互作分子的挖掘和筛选。 今天要为你介绍的dCas9-ChIP技术就是对Cas9蛋白进行一些位点突变,与ChIP联用实现核酸的富集以及DNA-RNA-蛋白的互作验证。话不多说,先上文章。 这篇2020年发表在《Journal of Hematology & Oncology》(影响因子5年内从5升到11,真是...