CRISPR-dCas9系统简介 dCas9蛋⽩是Cas9蛋⽩的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发⽣突变。因此，dCas9蛋⽩的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进⼊基因组的能⼒。CRISPR-dCas9系统提供了⼀个研究定点转录调控的平台。在这个平台中，dCas9主要是与其他效应蛋⽩融合（如GFP、...
comparison of the activation performance of dCas9-VP64, dCas9-VPR,and dCas9-SAM of the RHOXF2 gene. 2.dCas9-KRAB—CRISPRCas9基因抑制系统 单独的dCas9与靶位点的结合在空间上可以干扰转录酶的结合,起到抑制靶向基因转录的作用,这一过程称为CRISPRi(或CRISPR干扰)。这个简单的CRISPRi系统可以高达1000倍抑...
CRISPR/Cas9系统已不仅仅是一种革命性的基因编辑工具,还能在各种原核和真核生物中调控基因转录。Cas9的核酸酶发生双突变产生“钝化”和“死亡”Cas9,即“dead Cas9”,这种核酸酶失去切割DNA的功能,但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。 近年来,由CRISPR/Cas9衍生而来的CRISPR-dCas9系统已被用于基因成...
Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH,它们分别负责切割DNA链的两条链,将这两个保守的核酸内切酶结构域进行突变,其中RuvC催化结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)以及HNH催化结构域的第840位组氨酸突变为丙氨酸(H840A),Cas9蛋白将失去核酸内切酶活性,失去活性的Cas9称之为dead Cas9(dCas9)(Qi ...
2013年,Larson等人在大肠杆菌中首次证明了单独的dCas9就可以作为转录抑制子并实现序列特异性基因转录抑制,并证明CRISPRi这种系统是在基因组范围内选择性干扰基因表达的简单方法(Larson et al., 2013)。两年之后,Piatek等人将dCas9的C端与SRDX的转录阻遏结构域融合并成功用于植物细胞中内源基因的转录抑制(Piatek et al...
CRISPR-Cas9是一套细菌内的获得性免疫系统,抵御外界病原体入侵。其中,被广泛运用的是SpCas9。研究表明,对SpCas9蛋白上的保守残基进行失活突变(D10A,H840A),蛋白会失去核酸酶活性但依旧保留结合酶活性,这样的蛋白被称为dCas9(deactivated Cas9)。dCas9蛋白具有出色的DNA靶向性,因此许多团队利用该系统开发DNA成像工具...
其剪切酶活性丧失，只保留了由gRNA引导进入基因组的能力。目前，CRISPR-dCas9系统已被广泛应用于基因调控...
在“谈谈CRISPR/dCas9系统的“百变”应用(一)”中伯小远主要给大家讲解了CRISPR/dCas9的基础背景知识,以及该系统在基因的激活与抑制、表观基因组编辑(DNA甲基化修饰、组蛋白修饰)这两个方面的应用情况。除此之外,CRISPR/dCas9系统在基因组学研究中的应用还包括:单碱基编辑、靶向染色质拓扑结构、植物活细胞染色质...
CRISPR/dCas9的应用领域 1. 基因激活与抑制 通过将dCas9与转录激活因子如VP64、EDLL融合，可以实现特定基因的转录激活。在植物中，dCas9与EDLL融合的系统能够强烈诱导内源基因的转录激活。此外，dCas9-SAM系统通过sgRNA的修饰，可以招募额外的转录激活因子，从而增强激活能力。2. 表观基因组编辑 CRISPR/...
CRISPR/Cas9和dCas9系统有很多优点。第一,这项技术非常简单,我们只需要设计合适的gRNA就可以实现对任意目标基因的编辑;第二,这项技术十分高效且灵活,gRNA和Cas9或dCas9蛋白的结合具有很高的亲和力和特异性,可以快速地找到并编辑目标基因,而且只要对gRNA和Cas9或dCas9蛋白稍加改造就能实现不同类型的基因组编辑;第三,这...