gRNA (或称向导 RNA)是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分:一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对,引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。 什么是SgRNA? sgRNA 代表单向导 R...
(1)如果你要敲入的基因不参与翻译(enhancer之类的元件),那么你只要管在你想插入的附近设计gRNA即可,并且根据敲除位点附近的序列设计donor载体(关于donor载体的设计在后文会详细介绍)。 (2)如果你要敲入的基因参与翻译,并只是想让该蛋白表达蛋白,那么将外源基因插入到基因组中的safe harbor位点则是一个很好的选择。几...
7. 根据之前从NCBI下载的P53基因组序列信息,复制需要进行RNA编辑的目标区域序列,并粘贴到Step1中,在step2中选择物种信息,在step3中选择实验室常用到cas9蛋白和PAM序列NGG要的选项,然后点击SUBMIT提交。 8. 根据网站设计不同的gRNA,选取合适和评分最高的gRNA即可出。 9. 最后在设计好的gRNA序列的5'端点引入酶切位...
这将打开显示该特定gRNA的潜在脱靶位点的页面,甚至提供可用于通过SURVEYOR测定来筛选这些脱靶位点潜在突变的引物序列。 CRISPR Design 使用CRISPR Design的主要优势在于能够提供所有潜在gRNA的脱靶目标的详细信息。 它使每一个gRNA序列都发生了突变,并提供了关于其脱靶位置和与设计的gRNA错配数目的详细报告。 当设计两个gRN...
CRISPR-Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于通过研究感兴趣的基因,以及编辑疾病相关基因来进行基因治疗。在这项技术中,Cas9核酸酶与向导RNA(gRNA)一起被递送到细胞中,gRNA引导Cas9核酸酶到基因组中的特定位置。通过Cas9核酸酶切割基因组,造成DNA双链断裂,进而实现基因的敲除或添加。
CRISPR技术的原理是通过gRNA在指定的DNA位点诱导双链DNA断裂,然后断裂位点就有可能通过非同源末端连接通路(nonhomologous end joining pathway,NHEJ)完成基因编辑。但NHEJ本身是概率发生,所以理论上CRISPR无论敲除或插入都不可能达到100%的编辑效率[25]。 现有的临床...
为了帮助科学家设计 gRNA,学术界已经开发了超过 30 种基于网页的 gRNA 设计工具。 Nature Method编辑着重介绍了由来自哈佛大学与 MIT 联合成立的博德研究所学者 John G. Doench 于 2020 年 4 月 13 年发表在Nature Biotechnology的综...
预测gRNA的活性 已经研究了使用基于序列和其他特征来表征可能具有活性的gRNA的能力,不仅对Sp Cas9,而且对其他一些Cas酶也是如此。似乎没有一个通用的评分系统来选择gRNA,因为产生指南的方法(合成、体外转录或慢病毒递送)会影响预测评分的准确性,以及目标的动态(例如,由于染色质状态导致的可及性)。没有哪种预测方法是...
位置和序列是设计 gRNA 的重要考虑因素,但靶向基因中的位置对于插入缺失可能并不那么重要,重要的是设计的gRNA序列具有高度特异匹配度,有高切割效率并减少脱靶。对于 CRISPRa 和 CRISPRi,这些考虑因素同等重要 (靶标应该在 TSS 附近,但我们可以不过分担心序列优化问题,因为通常可以选择的序列较少) 。最后,位置因素对于...
手动设计gRNA步骤: 明确Cas蛋白及其对应PAM序列 SpCas9 =NGGORCCN 在目的基因片段中找到PAM序列; 选取PAM序列5‘端的20个核苷酸(不包含PAM); 检测序列的特异性(blast):在基因组层面对gRNA进行比对; 检查一下gRNA的5’端是否为“G”,如果没有的话就在5’端加一个G; ...