CRISPR-Cas9是一种细菌获得性免疫,用于降解入侵的外源 DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA, tracrRNA)退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列,引导Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂。 (图1 CRISPR-Cas9系统示意图) 当DNA形成双链断裂切口后,即可触发体内细胞主...
sgRNA简介 什么是gRNA? gRNA (或称向导 RNA)是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分:一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对,引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。 什么是SgRNA?
2012年,Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier证明CRISPR Cas9系统可以在体外切割双链DNA [1];2013年,张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑 [2]。 天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成:SpCas9 (以下简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。其中,crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guide RNA)...
是否提供两部分合成 gRNA? sgRNA 代表单向导 RNA,与传统的天然化脓性链球菌 CRISPR-Cas9 系统不同,其使用两部分向导,其中 CRISPR RNA (crRNA) 与 tracrRNA 杂交。sgRNA 将两个 RNA 结合成单个长 RNA。sgRNA 的长度通常为 100 nt,可以从载体表达或化学合成。 由于与双部分 gRNA相比,修饰的 sgRNA 在更多类型的...
图1.CRISPR gRNA 和 Cas9 蛋白。 图2.CRISPR-Cas9 系统。 在细菌中,CRISPR 位点由一系列重复序列组成,这些重复序列被 30bp 左右长度的外源 DNA 间隔开来,这些外源 DNA 称为间隔区序列(spacer)。重复-间隔的阵列被转录为一条较长的前体RNA,其中的重复序列被加工并生成定义了靶标序列的短小 crRNA(也称为...
一、CRIPSR/Cas9实现基因敲除的原理 CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割,造成双链DNA断裂,然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复,即非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR),而...
CRISPR/Cas9实验步骤 1. gRNA设计：选择目标基因的DNA序列，设计与其互补的20 bp的gRNA，同时考虑到PAM序列（通常为NGG）。使用在线工具（如CRISPR Design Tool）可以帮助寻找最佳靶点。2. 构建表达载体：将gRNA序列克隆到gRNA表达载体中，通常还需要Cas9表达载体或将gRNA和Cas9基因融合到同一个质粒上。3. 细胞转染或...
CRISPR-Cas9基因编辑技术,通过向导RNA(gRNA)将Cas9酶靶向目标DNA序列,Cas9酶切割目标DNA双链,造成DNA双链断裂,DNA在非同源末端连接(NHEJ)修复时出错,从而实现基因敲除。 然而,CRISPR-Cas9存在较为严重的脱靶效应,可能会在错位的基因位点切割DNA双链,从而导致潜在风险,这也是限制CRISPR-Cas9基因编辑临床应用的一大因素。
目前gRNA设计的一个主要挑战是如何快速找到高特异性且高效率的gRNA。尽管已经有很多gRNA设计工具,但都是基于gRNA序列和结构特性,而把gRNA-DNA结合模式、结合能变化和gRNA展开的自由能变化与切割效率结合起来的分析仍然缺乏,且对CRISPR/Cas9如何调节靶向性和特异性的理解仍然不完整。
riboEDIT™ CRISPR-Cas9是锐博生物自主开发的采用天然复合物系统的即用型(Ready-to-Use)基因编辑体系,gRNA采用crRNA和tracrRNA,提供全RNA体系(crRNA+tracrRNA+Cas9 mRNA)和RNP体系(crRNA+tracrRNA+Cas9 Protein),充分借助化学合成技术优势和质谱检测以确保质量稳定,通过化学转染、显微注射或电穿孔/电转进行编辑,是大规...