目前设计sgRNA的网站比较多,张锋老师实验组总结了sgRNA设计工具如:https://zlab.bio/guide-design-resources,其中synthego(https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool)是小编比较喜欢用的设计工具。不过该网站只能设计人、果蝇和小鼠基因的sgRNA。以人的基因TP53为例,介绍TP53基因sgRNA的设计过程。
如上图所示,序列中PAM和sgRNA的序列放大(前提是sgRNA位于CCDS区域,而且特异性要保证): 如上图所示,让Cas9切割位置(确定的)跨过一个酶切位点(比如sfcI)(在前两篇文章中都有所提及)。这样,在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候,酶切位点一定...
四、讨论 已经提出了大量工具来帮助设计CRISPR-Cas9指南。 其中许多,特别是我们研究中的三个,已经在实验上成功使用:CasFinder已用于设计人类基因组以靶向特定基因的指南[29],CRISPR-ERA已用于设计靶向HIV-的指南 1个病毒基因组[30]和mm10db已用于小鼠基因组的全基因组分析[6]。 但是,它们的性能几乎没有比较。 本...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切割,如下图所示。 因此本实验的关键步骤是设计一对20bp(不包括NGG...
CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计(上) 前言: 在上一次文章中,我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列,经由简单评估后选择出合适的sgRNA 1. 使用Snapgene anneal oligo 以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例,根据给出的PTEN sgRNA,完善oligo序列,并再Snapgene软件中匹配出来 ...
因此本实验的关键步骤是设计一对20bp(不包括NGG在内的)完全互补的oligo插入到如上图所示的filler。另U6启动子需要5’端的G起始转录,因此若设计的oligo第一个碱基非G,需额外增加一个G。 操作详细流程 1. 设计sgRNA 关于sgRNA的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析》[点击此处阅读] ...
gRNA(guided RNA)是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分,由两部分组成,分别是tracRNA和crRNA。其中crRNA引导cas9定位到要编辑的DNA序列附近,它有一段序列与tracrRNA的一部分是同源的,因此这两者可以部分结合。 tracrRNA的作用在于:形成一个茎环结构,与Cas9蛋白结合,示意图如下所示: ...
手把手教你利用CRISPR-Cas9系统精准敲除靶标基因 埃里克·兰德:CRISPR英雄谱——完整精译本 RNAi、TALEN、CRISPR:一文教你做出正确选择 一文掌握CRISPR/Cas9系统操作方法,超详细protocol来袭! 一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析 当CART小姐遇上CRISPR先...
2.2 Cas9: an RNA-guided nuclease for genome editing--详细介绍Cas9 CRISPR RNA (crRNA) array,编码gRNA,再加上tracrRNA,则可达到定位+编辑的功能gRNA用于引导,tracrRNA用于结合靶点。所以,人们就把crRNA和tracrRNA合在一起,成为了single-guide RNA,即sgRNA,而通过修改tracrRNA的序列,在理论上可以on-target任何目的...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切割,如下图所示: ...