手动设计gRNA步骤: 明确Cas蛋白及其对应PAM序列 SpCas9 =NGGORCCN 在目的基因片段中找到PAM序列; 选取PAM序列5‘端的20个核苷酸(不包含PAM); 检测序列的特异性(blast):在基因组层面对gRNA进行比对; 检查一下gRNA的5’端是否为“G”,如果没有的话就在5’端加一个G; ...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切...
(5) CRISPR-Cas9 技术 cas9_6.png (6) Genome editing using CRISPR-Cas9 genome_editing.png 蓝色是自己设计的20bp的gRNA序列; 而切割位点在NGG的上游某个位置,_-20bp之间。 细菌中,Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置,形成平末端产物。 有两种修复切口的方法: 自然修复 提供一个外源 templa...
CRISPR/CAS9 原理(极简) 德国的秃头兔子 2.1万0 设计gRNA序列克隆到Cas9表达质粒用于KO实验 小云爱生信 12:05 CRISPR-Cas9 复盘 生生物物生生 40953 1:20:47 表达载体构建 田田少田田 3.3万68 18:43 CRISPR/Cas9基因编辑第二讲 广州艾迪基因 88190
在线设计gRNA的工具 一、着重推荐Lei Stanley Qi Lab的http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp 这个在线站点功能比较丰富,可以选择基因编辑工具的其他用途(激活,抑制基因表达等)(如上图所示)。下一步就是选择物种。但只有常见的9种。再下一步...
CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计(上) 前言: 在上一次文章中,我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列,经由简单评估后选择出合适的sgRNA 1. 使用Snapgene anneal oligo 以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例,根据给出的PTEN sgRNA,完善oligo序列,并再Snapgene软件中匹配出来 ...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切割,如下图所示: ...
的基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在⽬的⽚段⽣成DNA双链断裂，如下图所⽰。通过基因⼯程⼿段对crRNA和tracrRNA进⾏改造，将其连接在⼀起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对⽬的基因进⾏基因操作，在...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA(single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切割,如下图所示: ...
使用Snapgene一键生成oligo，Actions--Anneal Oligos 粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件 （1）打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment （2）在Vector选项卡，选择内切酶为BbsI，在insert部分选择上一步中保存好的oligo，最后点击clone，保存DNA文件。（3）打开插入后的质粒图谱...