方案三:标签类(Flag,HA,GFP,myc等)IP通过过表达方式,将目标IP蛋白带上Flag,HA,GFP,myc等标签,可极大方便后续的实验检测。 ①可直接选择现成的Flag beads或者磁珠,IP实验会比较容易操作,由于标签抗体非常成熟,IP抗体与WB抗体选择不同种属来源,即可避免轻重链问题。 ②WB选择直接HRP标记的标签抗体(如Flag-HRP mab)...
5、 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃1 h以去除非特异性杂蛋白,降低背景。 6、4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中标号Input,留Protein A珠子,标号IP。 7、变性以及还原蛋白 室温溶解蛋白上样缓冲液(5×),按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合,IP组...
🛠 实验步骤: 用RIPA裂解缓冲液裂解细胞。 用PBS配制50%的Protein A/G-agarose工作液。 加入Protein A/G agarose工作液,4℃摇动10分钟去除非特异性蛋白。 4℃,14000g离心15分钟,去除Protein A/G-agarose微球。 使用BCA法或其他方法测定总蛋白浓度。 加入一抗,4℃过夜。 14000g离心收集沉淀,用预冷洗涤缓冲...
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程 一、原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
Co-IP的实验步骤可大致概括为以下4步：（1）裂解蛋白，得到蛋白的混合物；（2）将靶蛋白的抗体与蛋白混合物共同孵育；（3）洗脱，得到拉下来的蛋白；（4）再将拉下来的蛋白当作样本，用其互作蛋白的抗体进行检测。3、实验结果图解读 在了解实验流程的基础上，为了来帮助大家看懂实验结果图，我们通过案例展示形式...
因此，Co-IP的实验步骤可大致概括为以下4步：（1）裂解蛋白，得到蛋白的混合物；（2）将靶蛋白的抗体与蛋白混合物共同孵育；（3）洗脱，得到拉下来的蛋白；（4）再将拉下来的蛋白当作样本，用其互作蛋白的抗体进行检测。图1 Co-IP实验原理及流程（伯远生物科研绘图）。Co-IP结果如何看？虽然了解过Co-IP的原理...
实验步骤。 1. 细胞培养与处理。 根据实验目的,培养适量的细胞,并对细胞进行相应的处理,如刺激、转染等,以诱导或调节目标蛋白质的表达和相互作用。 2. 细胞裂解。 去除细胞培养液,用预冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞2-3次,以去除残留的培养液和血清等成分。 向培养皿或培养瓶中加入适量预冷的细胞裂解液,通常...
1.对于内源的 Co-IP 检测应该用 10 cm 皿来培养目的细胞,并维持较好的生长状态; 2.如果该实验用于新蛋白的鉴定,应注意抗体重链和轻链的影响; 3.该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。 常见问题 1、阴性有较强的条带 这有可能是结合较弱或...