通过BLAST验证,确保设计的引物具有高度的特异性,不会扩增出其他非目标DNA区域。这是ChIP实验成功的关键之一。 ▲PCR验证: 在含有目标DNA的模板和不含目标DNA的负对照样本上进行PCR验证,进一步确认引物的特异性。 ▲ChIP-qPCR结果分析: ●标准曲线的建立: 通过稀释不同比例的Input样本建立qPCR标准曲...
重复的核苷酸序列可能会导致引物在PCR过程中形成二级结构,影响扩增效率。 ●避免自互补结构: 引物应避免形成自身互补结构或内部有自相似序列,以防止引物间相互结合或引物自身的结构变化。这有助于保持引物的稳定性和扩增效率。 ●3'端设计:引物的3'端应尽量避免包含重复核苷酸,以确保扩增产物的长度准确。3'端...
qPCR引物设计流程与普通PCR一致,但相较于普通PCR的引物设计原则,qPCR更为严格,具体如下:1. 引物的退火温度要高,一般要在60℃以上;2. 引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可; 3. 对于定量PCR来说,特别是在使用SYBR Green的情况下,引物二聚体的存在对结果的干扰较大,所以在选择引物时要尽量避免容易...
那好,接着用这一段序列去设计引物。我们先如下打开NCBI的引物设计页面: 在这个页面设计引物的时候,我们只要修改产物长度就行,我们只要100-150bp左右的产物就行,对于做ChIP-qpcr来说的话。因为如果你设计太长了,在你做ChIP的时候如果超声把DNA打的太短,...
如图,这个 ChIP-Seq 的数据的各个质控参数都还可以,PBC>82%,表明建库过程中没有 PCR bias。用 Phastcon 检测 ChIP-Seq 数据中结合位点的保守性,因为 TF 的 DNA 结合序列在物种间相对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
6.对于长片段或长DNA片段的区域,如果设计上没有合适的PCR产物插入目标区域,可以考虑设计探针以便于后续直接捕获分析。 7.在进行基因芯片设计时,要考虑设计的通用性,以便于不同生物基因组或不同组织样本的后续分析。 总的来说,Chip引物设计是一个精细平衡的过程,需要考虑到许多因素,包括但不限于引物的长度、温度、...
这时,如果一定要做阳性对照,还可以采用另一个方案,使用阳性抗体histone H3抗体配合靶基因的特异性引物来做PCR,因为任何靶基因都有组蛋白的结合,所以histone H3抗体免疫沉淀下来的DNA用靶基因引物做PCR也肯定会产生阳性信号。 使用者针对目的DNA 设计适宜的特异性引物至关重要。
问:染色质免疫沉淀分离出来的DNA序列怎么设计引物PCR扩增啊,要测序码,怎么知道转录因子结合的序列? 答:根据你目的基因的某一段序列设计引物,普通引物就可以,然后用ChIP拉下来的作为模版,如果扩到了就说明有结合,当然了,如果想得到确切结论一定要设置好阴性对照和阳性对照才可以至于怎么知道转录因子结合的序列,如果没人...