摘要:本发明提供了一种CAR‑T治疗载体及其构建方法和应用。该CAR‑T治疗载体,包括AXL scFv;所述AXL scFv包括依次连接的AXL单链抗体轻链可变区,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;linker接头,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;AXL单链抗体重链可变区,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。构建的CAR‑T治疗载体能够很...
性靶向受体蛋白MAGEA及其CAR-T载体的构建方法,所述构建方法包括,先提取抗骨肉瘤的单克隆杂交瘤细胞的RNA,然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR,将抗体重链和轻链的可变区DNA片段克隆到T载体上,测序,获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白MAGEA,并将其表达序列克隆到CAR-T载体上,获得特异性靶向MAGEA的新型CAR-T载体...
在本发明的第二方面,提供一种上述car-t治疗载体的构建方法,包括以下步骤:(1)将如seqidno.1所示的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核复制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒复制子sv40ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1绿色荧光蛋白、如seqidno.12...
B2、经无缝克隆的方法,将DLK1单链抗体基因序列插入到CAR表达载体上,并测序验证插入序列是否正确。 6.一种用于针对肝癌相关抗原DLK1为靶点的CAR-T构建方法中的慢病毒上清,其特征在于,将如权利要求4或5所述的DLK1-CAR载体与慢病毒的包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染于293T细胞,感染后收集病毒上清,即所述慢病毒上清。
本发明的目的之二在于提供一种用于在结肠癌治疗中应用的CAR-T载体的构建方法,其包括以下步骤: 1)将CAR基因序列合成后保存在PUC19质粒上; 2)将含有慢病毒表达载体的菌株和含有步骤1)所得到的PUC19质粒的甘油菌进行增菌培养后,提取质粒,并分别利用EcoRI与NotI双酶切; 3)将步骤2)所得到的酶切产物分别经过琼脂糖...
本发明公开了用于CAR‑T细胞制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤细胞制品中的应用,同时本发明还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法,为临床应用提供了检测标准。本发明提供的慢病毒载体具有长度小,在T细胞中能够稳定、高效表达CAR基因,在病毒包装细胞如HEK293T中可以包装出高滴度的慢病毒、不含GFP、Neomycin等...
本发明公开了一种用于制备CAR‑T的慢病毒载体质粒及其制备方法和用途,含有双启动子;酶切位点充足,易于插入基因;含有T2A序列,T2A序列能使连接的两个基因同时表达;本发明的用于制备CAR‑T的慢病毒载体,酶切位点充足,组件丰富,易于改造,方便载体的构建;本发明的用于制备CAR‑T的慢病毒载体应用广泛,可用于构建单...
[0021]提供一种针对胰腺癌的双靶点CAR‑T治疗载体的构建方法。 [0022]将上述CAR结构按照基因序列, 采用常规生物合成方法进行合成, 合成后的CAR存在于PUC57质粒载体上; 慢病毒表达载体pLenti6.3/V5购自invitrogen。将PUC57质粒载体和慢病毒表达载体均采用BamHI、 XhoI双酶切, 将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离, 回收...
本发明的的第一个方面是提供一种基于piggybac载体的cd-133-car-t系统构建方法,其是通过设计合成cd-133-car基因片段,然后将cd-133-car基因片段连接到piggybac载体上得到piggybac-car-cd-133,再将piggybac-car-cd-133转入大肠杆菌中进行扩增,然后从大肠杆菌中提取质粒,并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养...
本发明涉及提供了结肠癌的双靶点CAR‐T治疗载体及其构建方法和应用。双靶点CAR‑T治疗载体由慢病毒表达载体pCDH‑EF1α‑MCS‑(PGK‑Puro)和CAR结构两部分构成。所述的CAR结构具体为Igkappa‑iRGD‑CEA scFv‑(G<Sub>4</Sub>S)<Sub>5</Sub>‑Her‑2scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ...