在本发明的第二方面,提供一种上述car-t治疗载体的构建方法,包括以下步骤:(1)将如seqidno.1所示的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核复制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒复制子sv40ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1绿色荧光蛋白、如seqidno.12...
研究使用临床前白血病的小鼠模型,Stephan和他的同事们将直接在体内注射CAR编码载体的方法与先化疗再输注在实验室中经过编程表达CAR的T细胞进行了比较,体内构建的CAR-T与传统灌注的CAR-T细胞相比毫不逊色。 小鼠实验表明,利用纳米颗粒或灌注的CAR-T细胞进行治疗可让这些小鼠的存活期从平均两周增加到平均58天。 ▲人源...
本发明的用于在神经胶质瘤治疗中应用的car-t载体的构建方法为:将car基因序列合成后存在于puc19质粒载体上;将puc19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ecorⅰ、notⅰ双酶切,将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离,回收目的条带,得出载体和目的片段的浓度,将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化后进行质粒提取,最终获得含有特定car结...
步骤六,带有cd-133-car基因的t淋巴细胞构建,从人血清中分离淋巴细胞,并加入t淋巴细胞培养液,inf-γ,okt-3、hil-2和步骤五得到的质粒dna进行扩展培养,采用nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒piggybac-car-cd-133和piggybactransposase到t细胞中,得到带有cd-133-car基因的t淋巴细胞。 优选地,所述piggybac载体为p...
然后通过重组酶连接成双特异性嵌合抗原受体hc-metscfv-pd-1scfv-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ,插入到慢病毒表达载体pkc-ef1α-ds-red(pkc-空载体)中,构建抗人c-met/pd-1scfv-car表达载体(如图1所示);外送测序完全符合设计(如图2所示);利用该质粒与慢病毒的包装质粒vsvg和r-8.91在293t细胞中包装病毒,感染...
本发明的用于在结肠癌治疗中应用的car-t载体的构建方法为:将car基因序列合成后存在于puc19质粒载体上;将puc19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ecorⅰ、notⅰ双酶切,将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离,回收目的条带,得出载体和目的片段的浓度,将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化后进行质粒提取,最终获得含有特定car结构的...
进一步的,步骤(1)中,所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变,具体为:g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。进一步的,步骤(2)中,由人EF1α启动子启动整个CAR基因表达;CD8leader嵌合受体信号肽位于CAR编码序列的N端,用于引导CAR蛋白定位于细胞膜...