在car-t技术的实施中,最为关键的是慢病毒载体的构建,尽管慢病毒载体的研究有了很大进展,但距离临床应用还有很长的路要走。例如,重组病毒的滴度还不够高,除naldini等报道的结果外,其余均在103tu/ml～104tu/ml之间,难以达到体内应用的需要。造成重组病毒滴度低的主要原因之一是慢病毒的启动子表达强度大,在t细胞中...
在本发明的第二方面,提供一种上述car-t治疗载体的构建方法,包括以下步骤:(1)将如seqidno.1所示的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核复制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒复制子sv40ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1绿色荧光蛋白、如seqidno.12...
研究使用临床前白血病的小鼠模型,Stephan和他的同事们将直接在体内注射CAR编码载体的方法与先化疗再输注在实验室中经过编程表达CAR的T细胞进行了比较,体内构建的CAR-T与传统灌注的CAR-T细胞相比毫不逊色。 小鼠实验表明,利用纳米颗粒或灌注的CAR-T细胞进行治疗可让这些小鼠的存活期从平均两周增加到平均58天。 ▲人源...
一种car-t毒性指示细胞的快速构建方法,包括以下步骤: ①构建序列为seqno:1的慢病毒质粒,该慢病毒质粒携带以下外源基因片段:igkleader、avidin、cd28跨膜区、t2a序列及luciferase; ②慢病毒质粒大提,病毒包装制备得到慢病毒; ③慢病毒感染常用细胞x,通过嘌呤霉素筛选获取稳定表达荧光素酶luciferase和 抗生物素蛋白avidin...
本发明的用于在神经胶质瘤治疗中应用的car-t载体的构建方法为:将car基因序列合成后存在于puc19质粒载体上;将puc19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ecorⅰ、notⅰ双酶切,将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离,回收目的条带,得出载体和目的片段的浓度,将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化后进行质粒提取,最终获得含有特定car结...
car-t疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案。其通过体外基因转移技术,将编码嵌合抗原受体(car)的基因序列转导入t细胞中,生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性t细胞。针对多发性骨髓瘤的相关抗原主要包括:bcma、cs1、cd138、cd38和integrinβ7。cs1是一种细胞表面糖蛋白,在正常的浆细胞和超过95%的mm患者细胞...
一种基于piggybac载体的cd-19-car-t系统构建方法:根据piggybac载体的的特性,查找cd19的单链抗体可变区(scfv)基因片段序列,并设计合成包括来源于cd19抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体scfv,中间片段由cd8来源的连接和穿膜片段组成,膜内片段由传递信号的效应分子如cd3ζ组成,将合...
t是利用基因工程技术,将患者自身的t细胞分离体外,并在其表面表达一个能够特异性识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scfv)区域,实现精准靶向癌细胞并杀伤的目的。基因编辑后的t细胞表达一个car分子,主要由胞外单链抗体区、跨膜区及胞内信号传导区三部分组成,共同参与信号的传递和级联放大。
然后通过重组酶连接成双特异性嵌合抗原受体hc-metscfv-pd-1scfv-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ,插入到慢病毒表达载体pkc-ef1α-ds-red(pkc-空载体)中,构建抗人c-met/pd-1scfv-car表达载体(如图1所示);外送测序完全符合设计(如图2所示);利用该质粒与慢病毒的包装质粒vsvg和r-8.91在293t细胞中包装病毒,感染...
本发明的用于在结肠癌治疗中应用的car-t载体的构建方法为:将car基因序列合成后存在于puc19质粒载体上;将puc19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ecorⅰ、notⅰ双酶切,将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离,回收目的条带,得出载体和目的片段的浓度,将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化后进行质粒提取,最终获得含有特定car结构的...