蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
(2)实验操作步骤(以在PVDF膜上直接显色为例): ①蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质,利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率,通常采用SDS/PAGE技术。分离实验结束后,首先将样品墙的上边缘用小刀去除,然后在胶板的右上角切一个小口以便定位,小心放入转移缓冲溶液中待用。 ②电转移 准备PV...
蛋白质印迹法（Western Blotting）的6个基础步骤：1.样品制备2.通过凝胶电泳分离蛋白质 3.蛋白质转移（电印迹）到膜上 4.膜封闭 5.免疫检测6.靶蛋白显印 WB法可用于检测天然和合成来源的蛋白质。来自表达系统的重组蛋白和来自生物样品的内源蛋白都可以用蛋白质印迹法检测。对于要通过WB分析的蛋白质，首先必须要...
蛋白免疫印迹( Western Blot,WB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本SOP包括Western Blot 操作方法及常见问题分析,有助于成功完成 WB。 一、蛋白样本提取制备 1 细胞或...
一、原理蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或…
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤 一、总蛋白的提取 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1)吸除培养液 2)每皿细胞加 4℃预冷的 PBS。平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加...
实验流程 WB常规实验流程 步骤: 一、试剂准备 二、蛋白样品制备 三、蛋白含量的测定 四、SDS - PAGE电泳 五、转膜 六、免疫反应 七、化学发光,显影,定影 八、凝胶图象分析 实验准备 实验材料:蛋白质样品。 试剂、试剂盒:裂解液 PBS G 250考马斯亮蓝溶液 NaCl SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染...
(一般是先加PBS再加标准品,试剂先加多的,再加少的,也就是先按20、19、18、16、12、8、4、0μlH2O于96孔板的标准品孔中,再各加0、1、2、4、8、12、16、20μl标准品)b.首先加19μlPBS到96孔板的样品孔中,再加入1μl 我们步骤一中提取的蛋白上清(设复孔)c.各孔加入200μl BCA工 作液,37℃...
WB实验步骤 1、收集蛋白样品 蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏,因此,根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。 使用Western及IP细胞裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品,为了防止蛋白的降解,或保证磷酸化或乙酰化蛋白的稳定,需要额外添加蛋白酶抑制剂 / 蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等蛋...