将等量的蛋白质样品(通常为20-30 µg)与样品缓冲液混合,并加热(95℃,5分钟),然后加载到凝胶的样品孔中。 电泳: 以适当的电压(通常为80-120 V)进行电泳,直至染料前沿移动到凝胶的底部。 3. 转膜 转膜: 将凝胶与膜(PVDF或硝酸纤维素膜)用转膜缓冲液结合,并通过电转(通常为100 V,1-2小时)将蛋白质从凝...
蛋白质印迹法（Western Blotting）的6个基础步骤：1.样品制备2.通过凝胶电泳分离蛋白质 3.蛋白质转移（电印迹）到膜上 4.膜封闭 5.免疫检测6.靶蛋白显印 WB法可用于检测天然和合成来源的蛋白质。来自表达系统的重组蛋白和来自生物样品的内源蛋白都可以用蛋白质印迹法检测。对于要通过WB分析的蛋白质，首先必须要...
1、组织蛋白提取 1)所需器材:制冰机、标记笔、两套1.5ml EP管(最好高温高压处理)、一个大冰盒、一个1.5ml EP管盒、手套、眼科剪(最好高温高压处理)、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS(最好高温高压处理)、移液枪、吸头(最好高温高压处理)、两套研磨棒(最好高温高压处理)、掌上离心机...
(2)实验操作步骤(以在PVDF膜上直接显色为例): ①蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质,利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率,通常采用SDS/PAGE技术。分离实验结束后,首先将样品墙的上边缘用小刀去除,然后在胶板的右上角切一个小口以便定位,小心放入转移缓冲溶液中待用。 ②电转移 准备PV...
实验步骤 1. 蛋白质样品的制备与SDS-PAGE分离 1) 蛋白质样品获得 a. 细菌诱导表达后,样品一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解; b. 哺乳动物组织通常可机械分散(机械或超声波室温匀浆0.5～1min)并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液,然后4℃,13 000g离心15min,取上清液作为样品; ...
蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项 实验 方法 原理 Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是...
细胞内蛋白质印迹法实验步骤(细胞内蛋白质印迹法) A. 溶液与试剂 注:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):为了配制 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 7.4。
实验操作 1细胞裂解物的准备; 2细胞裂解物的蛋白定量; 3细胞裂解物的SDS-PAGE; 4蛋白质的转移; 6目的蛋白质的检测。 免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 测定相对含量时,需要内参照 选择合适的反应条件:SDS-PAGE胶浓度;转移膜的选择;转移时间的选择