说到Co-IP(免疫共沉淀)实验原理,就不得不提到IP(免疫沉淀)了:IP是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行亲和纯化的方法。基本原理是抗原-抗体特异性结合,检测目的是富集分离蛋白。 Co-IP是IP的延伸,主要是用于探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋...
4℃,14000g离心15分钟,去除Protein A/G-agarose微球。 使用BCA法或其他方法测定总蛋白浓度。 加入一抗,4℃过夜。 14000g离心收集沉淀,用预冷洗涤缓冲液洗涤3遍。 收集上清,进行SDS-PAGE、Western blot或质谱分析。📚 总结: Co-IP是研究蛋白质相互作用的经典方法,虽然存在一些局限性,但通过精心设计和操作,可以...
8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释 1:10 倍 以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月) 9. 用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如 10 μg/μl) 1...
蛋白样品通常通过裂解细胞得到。Co-IP实验通常有两种,一种为内源性蛋白相互作用验证,另外一种为非内源性蛋白相互作用验证,内源性相互作用是指两蛋白相互作用在细胞内发生,即通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达,表达完...
Co-IP免疫共沉淀实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 Co-IP免疫共沉淀技术应用 1、测定两种目标蛋白质是否在体内结合。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是一种以抗体和抗原之间的特异免疫反应为基础,研究蛋白质与蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入抗原特异性的抗体,抗体、抗原、以及与抗原具有相互作用的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物,经过纯化,洗脱,收集免疫复合物,SDS-PAGE电...
1. 在 co-ip 测定中，诱饵和猎物蛋白都处于其天然构象中。 2. 诱饵和猎物蛋白质之间的相互作用发生在体内，几乎没有外部影响。 co-IP 的结果反映了 体内 。 如果研究人员已经预测到潜在的相互作用物，则 Co-IP 可以与蛋白质印迹分析相结合，作为蛋白质相互作用验证的一种方式。 如果没有做出预测，coip 可以与...
Co-IP 协议与传统的 IP 协议非常相似,不同之处在于 Co-IP 需要更温和的测定条件来保持与结合伙伴的相互作用。 一般步骤如下(图1)。 图1:标准 Co-IP 协议中的步骤。 1. 裂解你的细胞 在这里,您轻轻地打开您的细胞,使您的蛋白质接触到抗体。 裂解方法在 Co-IP 中很重要。 非去污剂、低盐裂解缓冲液是...
1、测定两种目标蛋白质是否在体内结合；2、鉴定与特定蛋白相互作用的未知蛋白（通常与质谱连用，也称IP-MS）；3、分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。免疫共沉淀的优点 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；3、可以分离得到天然状态...
免疫共沉淀(co-IP)是一种研究蛋白质间相互作用的重要方法。以下是实验步骤的详细描述: 📌 制作蛋白标准曲线:使用Bradford法测定蛋白浓度。在测前,将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响。将定量后的蛋白分装,可以在-20℃保存一个月。