2、病毒感染(1/2小体积感染法):感染前,从冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化,吸去细胞原有培养基,加入1/2体积新鲜培养基(血清不影响病毒感染),如96孔板则加入50μL培养基,根据公式:每孔加病毒量(μL)=MOI×细胞数(感染时细胞数)/病毒滴度(TU/mL)×1000,计算不同MOI每个细胞孔需加入的病毒原液体...
GFP慢病毒感染细胞后,荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP前的启动子活性等因素。GFP基因荧光表达的强度与启动子的活性、目的细胞感染的病毒颗粒数呈正相关。慢病毒在增殖较快的细胞中感染48 ~ 72 h(腺病毒则是36 ~ 48 h),GFP蛋白表达才达到峰值;在增殖较慢...
GFP慢病毒感染细胞后,细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因前面的启动子活性等因素。 通常目的细胞感染慢病毒颗粒数越多,细胞本身增殖越快,GFP荧光会较强。慢病毒在增殖较快的细胞中感染96~120小时后,GFP蛋白表达才达到峰值;在增殖较慢的细胞中感染后,GFP蛋...
慢病毒不但可感染分裂或非分裂细胞,还可将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而实现持久表达,又不易引发机体免疫反应,被誉为“细胞实验佳选、体内实验必备”的工具病毒。 并且慢病毒作为基因治疗载体在各类遗传性和后天性的人类疾病的治疗中倍受欢迎:从基础研究到临床应用,高纯度、高滴度的慢病毒都是基因操作的理想...
次日进行慢病毒感染,此时细胞的融合度约为70%左右。 (2)准备病毒:取出4℃保存的病毒,使用瞬时离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可);如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量,将其稀释到培养基中,并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积,...
慢病毒不但可感染分裂或非分裂细胞,还可将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而实现持久表达,又不易引发机体免疫反应,被誉为“细胞实验首选、体内实验必备”的工具病毒。 并且慢病毒作为基因治疗载体在各类遗传性和后天性的人类疾病的治疗中倍受欢迎:从基础研究...
目的基因在细胞水平上的导入方式可以通过瞬转的方式进行,但想要长期在目的细胞中研究基因功能,可通过将外源DNA/shRNA和抗性基因包装至工具慢病毒载体中,重组慢病毒载体通过感染细胞将目的片段及抗性基因片段整合到宿主细胞染色体中,并随细胞分裂稳定传递,最后用抗性基因对应的抗生素对细胞进行筛选。建立了稳转细胞系可以降低...
一、慢病毒的储存与稀释 1、病毒液储存: 2、病毒液稀释: 二、慢病毒感染细胞实验步骤 三、特殊细胞的感染注意事项 关于舒桐 稳定转染细胞株可应用于重组蛋白、抗体生产、基因编辑、功能性研究和移植瘤构建等多种实验,已成为日常实验操作的一部分。目前构建稳定转染细胞株最常用的方法还是使用慢病毒感染细胞。慢病毒...
感染后48h,对于带GFP报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测GFP表达效率,如果要筛选稳定携带Puromycin抗性基因的病毒,则需换上含适当浓度Puromycin的新鲜完全培养液。附:部分细胞慢病毒感染参数 注:不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响,MOI值也略有差异,以下数据是在细胞感染效率在85-100%...