(1)Day 1,准备细胞:在 24 孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293T细胞,铺板时细胞融合率为50%左右,每孔加入100 μL培养基,培养箱中培养至细胞贴壁(针对贴壁细胞),进行病毒感染时细胞的最佳融合度为 70% 左右。 (2) Day 2,准备病毒:4°C保存的病毒,取出后轻轻用移液器混匀; -80℃冻...
4. 实验步骤 (1)胰酶消化细胞,无血清培养基重悬,调整细胞密度为0.5~1×105/ml(根据情况酌情调整),每孔200ul细胞悬液接种至24孔板,培养箱培养过夜。次日进行慢病毒感染,此时细胞的融合度约为70%左右。 (2)准备病毒:取出4℃保存的病毒,使用瞬时离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可);如果是冻存在-80℃...
(1)准备慢病毒颗粒:计算所需慢病毒颗粒的量,将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出,冰浴融化; (2)感染目的细胞:从培养箱中拿出细胞,置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度;如细胞状态较好,则开始实验: A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液,加入新的完全培养液; B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗...
1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中,以感染时细胞融合度在50%左右为宜(悬浮细胞根据需要调整,不要采用过高的细胞密度)。 2.感染 ⑴将2ul的Envirus-LV用25μl无血清稀释液稀释,充分混匀,制成Envirus-LV稀释液。4℃静置5分钟。 注:感染悬浮细胞,建议增大Envirus-LV到推荐用量的1-3倍,这样...
最早采用重组载体质粒、目的基因质粒、辅助质粒、腺病毒共转染细胞,步骤多、产率低、风险高;随后采用目的基因载体、AAV基因载体(rep/cap)、辅助质粒(包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似辅助功能的基因元件)共转染细胞,但包装效率低,生物风险高;Ad/AAV嵌合载体、辅助质粒感染恒定表达Rep/Cap细胞系的方法...
第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。通常，24孔板内以 5-8*10^4cells/孔的密度铺板。第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量 选择合适MOI值，进行病毒感染。加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液...
4. 实验步骤 (1)胰酶消化细胞,无血清培养基重悬,调整细胞密度为0.5~1×105/ml(根据情况酌情调整),每孔200ul细胞悬液接种至24孔板,培养箱培养过夜。次日进行慢病毒感染,此时细胞的融合度约为70%左右。 (2)准备病毒:取出4℃保存的病毒,使用瞬时离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可);如果是冻存在-80℃...
(1)准备慢病毒颗粒:计算所需慢病毒颗粒的量,将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出,冰浴融化; (2)感染目的细胞:从培养箱中拿出细胞,置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度;如细胞状态较好,则开始实验: A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液,加入新的完全培养液; ...
(1)准备慢病毒颗粒:计算所需慢病毒颗粒的量,将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出,冰浴融化; (2)感染目的细胞:从培养箱中拿出细胞,置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度;如细胞状态较好,则开始实验: A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液,加入新的完全培养液; B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗...
(2) Day 2,准备病毒:4°C保存的病毒,取出后轻轻用移液器混匀; -80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。 接着感染目的细胞:从培养箱中拿出细胞,观察细胞生长状态,如细胞状态好(细胞状态对转染影响较大),则可以开始实验。 a.吸去培养器皿中的旧培养基,用PBS清洗两次,更换新鲜培养基(如果细胞生长良好,没有大量漂...