引物作为PCR反应的核心组成部分,其设计质量直接影响到实验的成败。本文将详细介绍常规PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)以及ChIP-qPCR和MeRIP-qPCR的引物设计原则和流程。 一、常规PCR PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。
选择在三组数据中都有 peak 的区域,Zoom In。在有 peak 富集的区域选择 DNA 序列用来设计阳性对照的引物。对于你感兴趣的结合位点,可以先定位到基因,再根据 ChIP-Seq 的数据选择有 peak 富集的区域。 获取DNA 序列 获得DNA 序列了,就可以进一步利用 Primer 5 ...
设计引物就遵循一般引物设计规则就好，水解后的产物里只要包含一段就能pcr。担心水解太彻底，那就稍微短一...
1.首先通过UCSC获得特点位置的DNA序列 选择hg38的基因组 输入序列位置 即可获得DNA序列 2.通过DNA序列设计引物 BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov) 选择primer-blast 粘贴序列到PCR TEMPLATE,MAX选择250,C,G比例调节一下,其他按照正常设计引物来,get primer 利用UCSC-blast检测。选择in-silico pcr...
在正式进行CHIP实验前,可以通过PCR预实验来验证引物的扩增效率。通过比较不同引物在相同PCR反应条件下的扩增产物量,可以选择扩增效率最高的引物对进行后续实验。 综上所述,通过优化引物长度、调整GC含量、避免二级结构和反向互补、选择合适的退火温度、优化PCR反应条件以及进行PCR预实验验证等方法,可以确保CHIP引物的扩增...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
3、PCR的阳性引物对照:选做 4、Spike-in参照:选做 什么是ChIP spike-in? ChIP Spike-in指的是在一个ChIP实验中,在纯化富集得到的目的DNA片段混合液中掺入一定量的已知序列外源DNA片段(最常用的就是lambda噬菌体的DNA)用于整个实验的质控及标准化,后续的荧光定量PCR可以检测Spike-in,得到的Ct值可以作为内参对目...
一般做chip-qpcr的话，可以先用JASPAR去预测一下结合位点，然后根据位点去设计；或者有seq的结果的话就...